单反应同时定量10几种细菌或病毒，这个新型数字PCR技术什么样？
2026-7-3 11:07|
发布者: 沙糖桔|
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评论: 0|来源: PCR技术学习
摘要: 从一个灵感的闪现，到验证结果的出现，到在平台上的完善，走过了很多路，终于看到了越来越多欣慰的成果
| 今天给大家分享一个新的数字PCR技术，一种突破了荧光检测通道极限的多重定量检测技术。在常规的PCR技术中，通常在单管内，根据荧光通道数量的限制，仅能够区分出有限的靶标。并且，在常规的qPCR中，虽然可以实现多重检测，但实现多重定量难度极大，每一个靶标都需要独立的标准曲线，这不仅繁琐，还容易引入误差。数字PCR是专为核酸精准定量的技术，在实现多重定量中具有天然的优势。当前主流技术，在多重荧光通道下，通常可以实现1-4重的定量检测。但是，在可见光范围内，通常也只能一次实现6-7个波长的区分。更多的波长，或导至交叉干扰，降低单个荧光信号的信噪比，同时导至信号强度下降。追求在不增加荧光数量的前提下，实现更多重检测，是有很大价值和意义的。带着这一目标，笔者在几年前，提出了一种新的技术方案，经过多年的验证，也终究通过师弟的承接，把这个技术展现在了科研领域。既然在“光谱”这个维度上，我们能榨取的空间已经见顶，那为什么不换一个维度？传统的多重PCR，无论是qPCR还是早期的dPCR，本质上都是在“颜色”上做文章。我们通过不同的荧光染料来标记不同的靶标，这就像是在一个有限的调色盘里挤颜料，颜色越多，界限越模糊。但我们忽略了数字PCR的一个核心物理属性——“空间”。数字PCR的本质是将反应体系分割成成千上万个独立的微反应器（微滴或微孔）。在这个物理分割的过程中，每一个微反应器其实都自带了一个“空间坐标”。简单来说，我们不再单纯依赖“这个液滴发什么颜色的光”来判定靶标，而是看“这个液滴在哪个位置，同时发了什么颜色的光”。通过特定的探针组合设计，让不同的靶标在同一个荧光通道下，因为空间分布的不同，或者荧光组合的“有无”（类似二进制编码），被精准地识别出来。基于空间和颜色二进制编码的多重检测技术举个例子，如果我们有4个荧光通道，传统方法最多做4重。但通过这种编码逻辑，理论上我们可以将检测通量提升到一个全新的数量级，而且完全不需要增加新的荧光通道，也不需要担心光谱重叠带来的串扰问题。当然，这套逻辑要跑通，对仪器的要求极高。微反应器的体积必须绝对均一，空间坐标的定位必须精准到微米级，荧光信号的采集不能有丝毫的拖影。幸运的是，我们依托自研数字PCR平台，在微流控芯片的制造工艺和光学系统的稳定性上，给了我们足够的底气。在已经完成的验证实验中，我们仅用常规的4个荧光通道，就成功实现了9重靶标的同步绝对定量。无论是低丰度样本的检出，还是高浓度样本的线性关系，都表现出了极高的稳定性。意味着在未来的肿瘤液体活检中，你可以用极少的样本量，一次性筛查更多的突变位点；意味着在病原微生物检测中，你可以用更低的成本，实现更全面的联检；意味着在CGT（细胞与基因治疗）的质控环节，你可以把原本需要分好几管跑的指标，浓缩到一管里解决。技术的进步，往往不是靠推翻重来，而是靠换一个视角看问题。从“一色一靶”到“空间编码”，这不仅是数字PCR的一次技术迭代，更是我们对“精准定量”这四个字理解的深化。基于二进制编码的9种呼吸道细菌联检结果在这个工作中，我们展示了9种呼吸道细菌的定量检测的可能，在另一份工作中，我们同样实现了7种食源性致病菌的定量检测（哈哈哈，想了解的私信）。当然，还有很多基于这一技术的工作，比如在甲基化检测，转基因检测等领域合作者的工作均已完成，在陆续的投稿中（未发表之前，无法公开，嗯，就这样！）。从一个灵感的闪现，到验证结果的出现，到在平台上的完善，走过了很多路，终于看到了越来越多欣慰的成果。加油！
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