KASP基因分型不成功常见原因分析

（一）分型位点

1.没有做阳性对照，不能分型。

位点过于单一，实际上分型已经成功，但群体中只有一种等位基因型，因缺乏其它等位基因的对照，导至分型误判，建议加上阳性对照进行实验。

2.若只有杂合和一种亲本等位基因型，缺少另外一种亲本等位基因型。

（1）请检查群体是否为回交世代；

注：回交通常需要进行多次，通过回交所产生的后代称为回交杂种；回交过程中屡次与回交杂种回交的亲本被称为轮回亲本，未被用来回交的亲本称为非轮回亲本。在动植物育种过程中，常采用回交，使后代的整体性状或特征偏向于轮回亲本。

回交过程中，非轮回亲本的作用往往是提供少数几个优异基因，在后续的回交过程中，非轮回亲本的大部分基因都被替换掉，最终回交多次得到的后代与轮回亲本性状十分接近，仅从非轮回亲本获得少数基因。

（2）异源多倍体的位点多拷贝现象，请设计单一拷贝特异引物。

注：异源多倍体是指通过将不同物种的基因组组合在一起形成的多倍体，通常具有两个或多个不同来源的亚基因组。

（3）该等位突变纯合致死，无纯合现象或纯合现象罕见。

（二）样本

1.样本数量：建议每次基因分型DNA样本数量大于20个，反应DNA样本数量太少，反应DNA样本基因型单一或者遗传背景相似，都会导至无法获得3种不同基因型（AA,Aa,aa）而使基因分型失败。

2.DNA浓度过低：反应体系中至少添加5ng以上的DNA，大基因组物种添加量提高5-10倍投入量。

3.样本间浓度不均一：DNA含量过低的样本，重新制备，含量过高的样本，稀释后再检测。

4.DNA含PCR抑制剂：将模板梯度稀释后进行尝试或者重新纯化DNA。

（三）引物方面

1.引物自身扩增效率差：检查引物设计是否满足设计原则。

2.引物降解：在常温或者4度放的时间太长，影响扩增效果，重新合成引物。

（四）程序设置

1.循环数太少：大多数引物在总循环数38-40（10+28~30）的时候进入平台期，分型效果最佳。其中扩增效率较好的引物，在35个循环的时候，已经可以完美分型。少量引物，特别是GC含量低（30%以下）的部分引物，40个循环时仍然处于指数增长期，需要继续扩增3-5个循环才能达到最佳效果。

2.程序设置：排查是否设置为基因分型模式，是否采集信号。

（五）耗材

耗材不匹配：使用不合格的PCR板，请实验前确定耗材是否可以正常进行PCR实验。

（六）NTC起峰

1.水、枪头等出现交叉污染。

2.出现气溶胶污染影响结果判读。

3.循环数太多，引物自身扩增，建议多加几个NTC再看看。

4.引物设计问题，扩增产物中有引物二聚体存在，建议重新设计引物。

二、有分型趋势但是分的不明显

以28-34个循环作为标准的反应程序，由于不同的引物扩增速度以及效率不同，部分引物在28-34个循环时并不能达到反应终点，导至荧光信号较低，分群较分散影响数据分析。因此，当发现信号值较低，分群较分散但有分散趋势，可选择增加循环（95℃ 20s，55℃ 1min， 3个循环）直到观察到紧密且分离良好的基因分簇为止。如果NTC没有扩增，最多可加4次循环。

反应完成后的PCR板可在4度保存一周，荧光信号仍会比较稳定，一周以内加循环或者重读数据均可。

三、其它情况

出现单个严重离群点：检查该PCR孔内是否存在颜色污染；该PCR孔内是否漏加或者破损泄漏或者蒸发；可删除该数据点，并重新分析实验。

四、qPCR仪器做KASP基因分析检测注意事项

1.根据qPCR仪器型号订购合适的ROX水平的Master mix。

2.在40度以下读取KASP的终点荧光信号，分析数据时请注意调整XY坐标轴最大值最小值相当。

3.所有数据均建议在AUTOcall后进行人工判读。

4.建议样品板中加入经一代验证过的样品作为对照。

5.目标片段GC含量太高或者太低适当调整：

（1）高GC含量片段（GC%大于65%）：首先把标准的touch down程序（61℃-55℃）改为68℃-62℃。若效果不好，尝试加5%-10%Master mix体积的DMSO。

（2）低GC含量片段（GC%小于40%）：首先把标准的touch down程序取消，改为2步法。若效果不好，尝试加0.63%或1.06% Master mix体积的MgCl₂。