结核病仍然是全世界公共卫生面临的一个重大挑战，特别是在低收入和发展中国家，结核病是十大死亡原因之一。延迟治疗会增加疾病进展和并发症的发生，因此，监测低浓度结核病具有重要的现实意义。传统检测方法如痰涂片抗酸杆菌（AFB）镜检灵敏度不足，而细菌培养耗时长达数周，核酸扩增技术虽灵敏却依赖专业设备和痰样本，对HIV合并感染、肺外结核及儿科患者适用性低。 脂阿拉伯糖甘露聚糖（LAM）有望成为满足这些标准的诊断替代方案。LAM是结核分枝杆菌细胞膜的一种脂聚糖，可在尿液中检测到，且尿中LAM的存在与感染个体的细菌负荷成正比。但LAM在尿中的低浓度阻碍了当前的POC方法（如侧流免疫测定法）的实施。因此，仍然迫切需要便携式、经济高效、高灵敏度的诊断平台，能够检测低浓度的LAM。 近日，来自韩国的研究团队在杂志Nature communications上发表了一篇题为“Lab-in-a-cartridge for real-time detection of tuberculosis via precise measurement of urinary lipoarabinomannan”的文章。作者提出了一种便携式生物工具LIC系统，用于尿液中脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）的POC检测。采用比色反应，LIC实现半定量LAM检测，可在40分钟内在尿液样本中达到低至0.01 pg/mL的检测阈值。LIC在临床尿液样本中区分结核病患者的灵敏度为92%，特异性为88%，AUC（高准确度）可达0.91。这种开创性的设备不仅为检测低LAM浓度设定了改进的标准，而且还具有实现结核病分散诊断的潜力。 图片来源：Nature communications 本研究首创便携式 LIC系统，通过集成无泵流体驱动、磁捕获、酶放大和半定量视觉读数，克服了当前基于LAM的POC测试的主要局限性（图b）。该装置将分析操作模块和动力控制模块整合到手持设备中，可在短时间内实现LAM的样本到答案检测。此外，作者还将分析操作模块从转换器和电源控制模块的组合中分离出来，使设备的单位成本降至最低。 LIC利用磁性富集尿液中的LAM，辣根过氧化物酶（HRP）来放大信号强度，以及基于四甲基联苯胺（TMB）的比色法进行直接视觉分析，而无需额外的信号处理设备。LIC还可自动处理液体，无需复杂的实验室操作。LIC在自动化检测的驱动下达到的高灵敏度和高重复性，在农村和服务不足地区可以为结核病的分散监测作出重大贡献。
LIC系统示意图 图片来源：Nature communications 在优化了最佳检测条件后，作者使用真实尿液样本时遇到了在LAM分析中高非特异性信号的问题。通过优化磁珠浓度（1 mg/mL）、阻断剂（鲑鱼精DNA）及ConA抑制剂，作者成功消除尿液中糖类物质的非特异性干扰。结果显示，在0.01-1000 pg/mL浓度范围内，LAM检测呈线性响应（图f）。该系统在临床尿样中实现0.01 pg/mL的检测限，如此低的LOD值意味着微量LAM也可以在HIV阴性/结核阳性患者的尿液中检测到。
LIC的检测性能与灵敏度 图片来源：Nature communications 为了评估检测的特异性，作者测试了存在过量干扰生物标志物时LIC检测的性能表现。结果显示，即使干扰生物标志物浓度高出100倍，产生的信号几乎与空白相同（图g），只有LAM出现更高幅度的信号变化。作者还将结核分枝杆菌裂解物的信号与7种已知感染人类的细菌裂解物的信号进行了比较。结果显示，细菌裂解物产生的信号接近空白，而结核分枝杆菌裂解物诱导的信号明显增加（图h）。 此外，作者还检测了大量尿蛋白和代谢物，如IgG、葡萄糖、BSA、白蛋白和血红蛋白（图i），以及内源性物质（图j）（尿酸、尿素、肌酐、氯化钾、NaCl、NH4Cl、CaCl2）和外源性化合物（图k）（异烟肼、利福平、布洛芬和扑热息痛）的潜在干扰，均未观察到对分析信号的明显干扰。这些结果都说明，LIC对结核分枝杆菌裂解物具有高特异性。
LIC的特异性和选择性评价 图片来源：Nature communications 作者使用结核病阳性/阴性患者的临床尿液样本探索了LIC的实际可行性。结果显示，LIC能够区分40例非结核病患者中的35例和60例结核病患者中的55例，其中90/100例样本的LAM结果与临床诊断一致。作者还将使用LIC和ELISA检测的LAM结果与40例结核病阳性患者和20例结核病阴性患者的AFB涂片、培养和RT-PCR结果的常规方法进行比较（图c）。ELISA法仅检出2例阳性；RT-PCR区分了所有60例结核阳性、阴性患者；AFB涂片和培养的观察结果分别为31/40和38/40阳性，20/20阴性；LIC可以确定38/40的阳性结果和18/20的阴性结果。 总的来说，LIC系统表现出92%灵敏度(55/60)与88%特异性(35/40)，显著优于ELISA。其曲线下面积达0.91，满足WHO对结核病诊断工具的要求（灵敏度> 90%，特异性> 70%）（图f）。
LIC的临床验证结果 图片来源：Nature communications LIC可在40分钟内在尿液样本中达到低至0.01 pg/mL的检测阈值。LIC在临床尿液样本中区分结核病患者的灵敏度为92%，特异性为88%。这种开创性的设备不仅为检测低LAM浓度设定了改进的标准，而且还具有实现结核病分散诊断的潜力。 总的来说，LIC将复杂的检测流程集成于手持设备中，可在40分钟内完成检测，并在临床尿液样本中达到高灵敏度和特异性，可分离分析操作模块设计降低了仪器成本，这些特点都克服了当前基于LAM的POC测试的主要局限性，为结核病防控提供革命性解决方案，尤其对医疗资源匮乏地区的早期诊断具有重大意义。 |
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