基于CRISPR的诊断技术（CRISPR-Dx）近年来在诊断领域展现出巨大潜力。其高灵敏度、高特异性、单碱基分辨率、稳健的等温核酸酶活性以及无需复杂仪器的特性，特别适合现场快速检测。然而，传统CRISPR-Dx在临床转化中面临样本制备复杂、信号放大依赖预扩增、检测靶标局限等挑战。与分子诊断技术的同步兴起，纳米技术的快速发展为增强CRISPR-Dx性能提供了新机遇。"纳米-CRISPR"的融合有望通过材料创新解决CRISPR-Dx在灵敏度、多重检测能力和便携性方面的瓶颈，推动其向即时诊断和个性化医疗方向发展。 近日，德国弗莱堡大学、帝国理工学院和牛津大学在杂志Nature nanotechnology上共同发表了一篇题为“Convergence of nanotechnology and CRISPR-based diagnostics”的文章。在这篇展望中，作者总结了CRISPR-Dx 系统中纳米技术辅助策略，旨在解决传统 CRISPR-Dx 在样本制备、分析物检测以及信号读取方面所面临的问题。作者还讨论了当前的趋势，并展望了未来面临的挑战和机遇，包括非核酸靶标检测、无需预扩增的核酸检测、可穿戴设备的开发以及与人工智能工作流程的集成。 图片来源：Nature nanotechnology 由于样本存在很大差异性，样本制备是CRISPR检测流程中最具挑战性的环节。传统方法依赖化学裂解、物理破碎或混合纯化策略。金纳米结构可通过等离子体加热实现核酸释放，提高细胞裂解效率。 纳米材料还可能使采样方法更加非侵入性，并实现连续的单细胞监测，比如，石墨烯纳米片涂层的微针结合dCas9，可用于监测体液中的cfDNA。单链DNA功能化的碳纳米管凭借其高比表面积，可实现对病毒RNA的高效提取。磁性微珠已经用来捕获核酸靶标，但纳米级磁珠的开发有望通过更快的分离速度和更高表面活性，进一步提升诊断效率（下图a）。
CRISPR-Dx 样本制备中的纳米技术辅助策略 图片来源：Nature nanotechnology 尽管CRISPR-Dx主要用于检测DNA/RNA靶标，但通过适配体、DNAzyme（一类基于核酸的纳米催化剂）等分子转换策略，CRISPR-Dx已拓展至小分子、金属离子甚至完整细胞的检测（下图b）。比如，双链适配体可通过结构变化激活Cas12a，可实现腺苷检测。DNAzyme在捕获离子后，会释放出一条短的单链 DNA 链，从而激活Cas12a可检测铅离子。另外，使用蛋白酶响应型肽链与纳米载体相结合，可释放特定疾病对应的DNA条形码，再通过Cas12报告系统实现疾病特异性检测。 核酸预扩增是CRISPR-Dx中的一个重大挑战，但最近的研究已经探索了限域效应，以局部增加试剂浓度并改善检测动力学。微流控技术（如CARMEN平台）通过将CRISPR试剂囊泡融合实现多重检测，实现针对SARS-CoV-2及其他呼吸道病毒的临床检测的多重检测。皮升级液滴封装技术使单分子miRNA检测成为可能，检测灵敏度提升超10,000倍，朝着数字化、单分子定量的方向发展。 光热纳米镊子可将AuNP连接的报告分子、Cas效应蛋白和crRNA捕获在局部区域，并维持37°C反应温度，显著加速动力学过程。另一种策略是将FAM标记的报告分子和crRNA-Cas12a复合物锚定在20纳米金颗粒上，形成"CRISPR纳米机器人"，使酶与底物之间的距离得以缩短（下图b）。
CRISPR-Dx 分析物检测中的纳米技术辅助策略 图片来源：Nature nanotechnology 金纳米颗粒的聚集状态变化可用于肉眼可视化的检测（下图 e）。CASCADE平台通过Cas13a切割ssRNA稳定剂，引发金纳米颗粒"析出"效应，颜色由红变蓝，结合等温扩增后灵敏度可达aM级。
金纳米颗粒的聚集状态变化可用于比色读出 图片来源：Nature nanotechnology 酶催化系统已广泛运用在信号读出系统，比如辣根过氧化物酶（HRP）与葡萄糖氧化酶（GOx），但它们在长期稳定性、可扩展性和成本方面存在局限性。合成的纳米分子可提供一种替代方案。纳米酶是一类基于金属或金属氧化物的纳米粒子，它们具备生物酶的功能，同时保留了合成纳米粒子的通用性和稳定性。比如，铂核壳纳米颗粒（CrisprZyme系统）可替代天然酶，在比色检测中实现临床相关灵敏度，且无需使用荧光信号。 合成纳米颗粒系统也可用来代替小分子染料来在CRISPR检测中产生荧光，从而提高亮度、增强灵敏度，并解决光漂白等问题。金属有机框架材料（MOFs）可负载高浓度Cy5染料，在Cas12被激活后，这些 MOFs 会释放其携带的物质，从而产生无需预先放大即可实现定量检测的读数，可用于循环肿瘤DNA检测（下图c）。量子点凭借高量子产率和光稳定性，已在Cas13a侧流检测中用于SARS-CoV-2 S基因识别。另外，上转换纳米颗粒(UCNP)能够将多个入射光子“合并”成一个能量更高的荧光发射，可显著提高生物测定的信噪比。 纳米孔利用特定核苷酸的电学特征来对穿过绝缘膜中纳米孔的核酸进行测序。将纳米孔测序与CRISPR结合的一个关键例子是短串联重复序列的识别、定量和评估（STRIque）。通过Cas12和Cas9对目标序列进行富集和标记，结合核酸通过纳米孔时的电信号特征，可实现短串联重复序列的高通量分析。 晶体管技术能够在二维（2D）导电表面上检测分子的变化，新型纳米材料的应用可改善电化学传感器的灵敏度。例如，Cas蛋白对靶标的识别通过电压变化进行读取，读取效果因石墨烯的高导电性而得到增强，已经能够实现无标记检测miRNA。MXenes（化学稳定性强的金属碳化物）也进入了CRISPR-Dx领域。MXenes提供了完整的金属原子层以及大尺寸的羟基终止表面，用于ssRNA/ssDNA的固定以及可见光吸收，从而抑制荧光。这些特性，尤其是其与ssDNA强烈结合的能力，使得MXenes在CRISPR-Dx应用中极具潜力（下图c）。 最近还报道了纳米冲击电化学与CRISPR结合的应用，DNA水凝胶嵌入在银纳米粒子中。在目标识别后，Cas12a会切割三维纳米结构内的DNA，从而导至从凝胶到固体基质的相变。这种纳米结构三维材料的应用前景广阔，除了CRISPR-Dx，还可能在治疗领域得到应用（下图c）。
信号读出的纳米材料革新 图片来源：Nature nanotechnology 已有研究将CRISPR工具整合到可穿戴设备比如口罩中，以实现病原体检测，但当前仍局限于单次测量。未来需开发可重置的CRISPR系统，结合生物相容性纳米材料，实现连续监测。未来，AI可用于指导crRNA设计、光谱去卷积和结果解读。通过机器学习优化CRISPR引导序列的选择性，提高复杂样本中的检测准确性。未来还可将纳米材料用来优化多重检测。量子点、上转换纳米颗粒等可调发射纳米材料，结合光谱多路复用技术，可在单一设备中同时检测基因组、转录组、蛋白质组等多类生物标志物。 总之，纳米技术与CRISPR-Dx的融合正推动诊断技术向更高灵敏度、更强特异性和更好便携性发展。通过纳米材料在样本制备、分析物检测和信号读出三个关键环节的创新，不仅解决了传统方法对预扩增的依赖，还拓展了非核酸靶标的检测能力。尽管在临床转化中仍面临标准化、成本控制和监管审批等挑战，但通过跨学科合作和设备集成，这种"纳米-CRISPR"协同策略有望成为下一代即时诊断平台的核心驱动力。
集成CRISPR-Dx与纳米技术的未来设备 图片来源：Nature nanotechnology |
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