内容概览 近日，国际顶尖期刊《科学》旗下权威医学期刊《科学·转化医学》发表了一项具有里程碑意义的CAR-T细胞疗法研究。该研究由麻省总医院癌症中心细胞免疫治疗项目的Marcela V. Maus教授领衔，Stefanie R. Bailey博士与Hana N. Takei博士作为共同第一作者，联合多个顶尖团队共同完成。 研究团队通过创新性地敲除CAR-T细胞中的干扰素-γ受体，成功打造出新一代“IFN-γ抵抗型”CAR-T细胞。这种细胞在白血病、淋巴瘤、胰腺癌及三阴性乳腺癌等多种小鼠模型中，均表现出更强的扩增能力、持久性和肿瘤清除效果，甚至能建立长期免疫记忆，有效防止肿瘤复发。
研究背景 嵌合抗原受体（CAR）T细胞已彻底改变了血液恶性肿瘤患者的治疗格局，近期更有多款CAR-T疗法获批用于治疗B细胞淋巴瘤、B细胞白血病和多发性骨髓瘤。然而，该领域面临的临床挑战之一是复发问题，其发生主要源于肿瘤的抗原逃逸或CAR-T细胞植入与持久性不足。干扰素-γ（IFN-γ）是一种主要由T细胞和自然杀伤（NK）细胞释放的促炎细胞因子，在癌症中扮演复杂且有时相互矛盾的角色。最近研究证明，在血液肿瘤模型中，嵌合抗原受体（CAR）T细胞产生IFN-γ并非其发挥疗效所必需；而在实体瘤细胞中，IFN-γ受体（IFN-γR）信号传导则有助于CAR T细胞的粘附和抗原特异性细胞毒性。 主要结果 1 敲除IFN-γ或IFN-γR可促进CD28 CAR-T细胞在体外的扩增 本文作者此前曾报道，在靶向CD19、携带CD28或4-1BB共刺激域的CAR-T细胞中，基因敲除IFN-γ能在不影响血液恶性肿瘤抗肿瘤疗效的同时，限制其潜在毒性[2]。此外，我们发现IFN-γ敲除（IFN-γKO）的CAR-T细胞在体外对CD19阳性的Nalm6白血病细胞系表现出更强的扩增能力，尤其是在携带CD28共刺激域的CAR-T细胞中。为更深入研究IFN-γ信号传导对这些过程的影响，我们利用CRISPR-Cas9技术构建了靶向CD19、携带CD28共刺激域，并敲除IFN-γ或IFN-γR的CAR-T细胞。构建体使得我们能够利用一系列CAR-T细胞来研究IFN-γ信号传导的各个方面，这些细胞包括：（i）能够产生并响应IFN-γ的（CAR，对照组）；（ii）IFN-γ缺陷型，能够响应但不产生IFN-γ的（IFN-γKO CAR）；以及（iii）IFN-γ抵抗型，能够产生但不响应IFN-γ的（IFN-γRKO CAR）。
IFN-γKO和IFN-γRKO CARCD19 T细胞的增强扩增具有抗原依赖性，因为在缺乏抗原或白细胞介素-2的条件下，这些细胞无法存活或扩增。为探究该效应是否普遍适用于各类CAR-T细胞，还是仅限于携带CD28共刺激域的类型，我们构建了靶向CD19、携带4-1BB共刺激域的IFN-γKO和IFN-γRKO CAR-T细胞（图G和H）。与CD28 CAR-T细胞相反，我们发现对于携带4-1BB共刺激域的CAR-T细胞，敲除IFN-γ或IFN-γR并不能增强其在应对肿瘤细胞时的扩增能力（图I）。这些数据表明，IFN-γ信号通路特异性抑制CD28 CAR-T细胞（而非4-1BB CAR-T细胞）的生长。
2 IFN-γKO与IFN-γRKO CARCD19 T细胞在维持抗血液肿瘤活性的同时，于体内展现出更强的持久性 在体外经历多次Nalm6细胞反复刺激后，IFN-γ及IFN-γR敲除的CARCD19 T细胞仍能保持与对照组无异的细胞毒性潜能（图A）。研究人员给携带套细胞淋巴瘤细胞系JeKo-1的NOD SCID gamma小鼠分别输注上述各组CAR-T细胞，并持续监测其肿瘤负荷、生存情况及CAR-T细胞的扩增（图B）。结果发现，尽管存在一定的供体间差异，但IFN-γKO和IFN-γRKO CARCD19 T细胞介导的抗肿瘤效果（图C和D）与小鼠生存率（图E）与对照组CARCD19 T细胞相当。 IFN-γ信号通路敲除对CD19 CAR-T细胞的体外分化及耗竭状态影响甚微。 敲除IFN-γ或IFN-γR可保护靶向CD19的CAR-T细胞免于细胞死亡。
3 IFN-γ信号缺失可增强靶向间皮素的CD28 CAR-T细胞存活能力 与靶向CD19的CAR-T细胞类似，尽管在缺失IFN-γ或IFN-γR的CAR-T细胞中观察到CD4:CD8比率趋向更均衡的明显变化，但所有组别均表现出相似的激活状态和功能特征。活细胞成像分析和基于流式细胞术的微球计数均显示，IFN-γRKO CARMESO T细胞在接触间皮素抗原后表现出更强的扩增能力。当在体外用多种间皮素阳性的胰腺癌细胞系进行攻击时，与对照组CARMESO T细胞相比，IFN-γKO和IFN-γRKO CARMESO T细胞分别针对Capan-2或BxPC-3和Capan-2表现出更强的扩增。与靶向CD19的CAR-T细胞研究结果一致，IFN-γ信号的缺失并未导至CAR-T细胞在分化、免疫检查点蛋白表达或增殖能力方面出现差异。相反，抗原暴露后IFN-γ信号的缺失导至了CAR-T细胞凋亡性死亡的减少。这些数据共同表明，通过敲除IFN-γ，尤其是敲除IFN-γR来阻断IFN-γ信号传导，能够改善CAR-T细胞的存活，这一效果不受靶抗原特异性或表达靶抗原的细胞组织学类型的影响。
通过动物体内实验证明，虽然CAR-T细胞自身产生IFN-γ对于其抗肿瘤效力至关重要，但细胞本身响应IFN-γ的能力并非必需。 4 靶向EGFR的IFN-γRKO CAR-T细胞能够提供抵抗肿瘤再攻击的保护力 敲除IFN-γR能够产生具有长期抗肿瘤活性和生存优势的CAR-T细胞。此外，在对照CAR-T细胞失效的情况下，IFN-γRKO CAR-T细胞展现了抵御肿瘤再攻击的能力。这些数据表明，IFN-γ抵抗型CAR-T细胞在体内具有更强的扩增能力和记忆形成能力。 IFN-γRKO CAR-T细胞在三阴性乳腺癌同系模型中展现更强疗效与生存优势。
内容总结 在本研究中，作者发现IFN-γ会诱导带有CD28胞内信号域的CAR T细胞发生凋亡，而通过靶向IFN-γ或IFN-γR可以减轻这种凋亡。在血液恶性肿瘤中，敲除CAR T细胞的IFN-γR（IFN-γRKO）可在不影响疗效的情况下增强其持久性。在异种移植和同系实体瘤模型中，IFN-γR敲除的CAR T细胞表现出更强大的肿瘤控制能力、更长的生存期以及改善的T细胞记忆，从而能够保护小鼠免受肿瘤再次攻击。对荷瘤小鼠肿瘤浸润的IFN-γRKO CAR T细胞进行的RNA测序显示，肿瘤细胞的死亡增加。总的来说，这些数据表明，抑制IFN-γ信号传导可以增强基于CD28的CAR T细胞在液体和实体肿瘤中的扩增和抗肿瘤活性。
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