16S rRNA基因测序原理

这是一个关于16S rRNA基因测序原理的详细且系统的解释。无论您是初学者还是需要复习，都可以通过以下内容全面了解。

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什么是16S rRNA基因？

要理解测序原理，首先要了解测序的对象。

· 功能： 16S rRNA是原核生物（细菌和古菌）核糖体（蛋白质合成工厂）的一个组成部分。

· 基因： 编码这个rRNA的基因就叫做16S rRNA基因。

· 为什么选它？ 这个基因之所以成为微生物鉴定的“黄金标准”，是因为它具有以下两个关键特点：

  1. 保守性： 基因的某些区域在所有细菌中都高度相似，这允许我们设计通用的引物来扩增几乎所有细菌的这个基因。

  2. 可变性： 基因的其他区域在不同属、种的细菌之间存在显著差异，这些差异就像“条形码”一样，可以用来区分不同的微生物。

16S测序的核心原理

通过对所有样本微生物的16S rRNA基因的特定可变区进行PCR扩增、测序和生物信息学分析，来鉴定样本中微生物的种类（分类学组成）和相对丰度。

它的本质是一种 “分类学鉴定” 技术，而不是像宏基因组测序那样的 “功能探索” 技术。

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16S测序的完整工作流程

下图直观地展示了16S rRNA测序从样本到结果的完整流程：

第一步：样本采集与DNA提取

从任何感兴趣的生态环境（如人体肠道、土壤、水体等）中采集样本，然后提取样本中所有微生物的总基因组DNA。

第二步：PCR扩增（关键步骤）

使用针对16S rRNA基因设计的 “通用引物”，通过PCR技术特异性地扩增该基因的某一个或几个高变区。

· 常用高变区: V1-V2, V3-V4, V4-V5等。最常用的是V3-V4区。

· 为什么只测部分区域？ 因为目前主流的高通量测序平台（如Illumina）读长有限，无法一次性读完整个~1,500 bp的16S基因。选择一个或两个变异最大的高变区通常足以达到属级的分类分辨率。

· 在引物上会加上测序所需的接头（Adapter） 和样本标签（Barcode），以便后续在测序仪上混合多个样本进行测序（多重测序）。

第三步：建库与高通量测序

将扩增好的PCR产物构建成测序文库，然后使用Illumina等测序平台进行高通量测序。测序完成后，会得到数以百万计的短DNA序列读数。

第四步：生物信息学分析（核心分析流程）

这是将原始数据转化为生物学见解的关键。

1. 数据质控与过滤： 去除低质量、长度异常的序列以及引物和接头序列。

2. 序列聚类/去噪：

   · OTU方法： 将相似度高于97%的序列聚类成一个“操作分类单元”，通常代表一个“物种”水平。然后从每个OTU中挑选一条代表性序列进行注释。

   · ASV方法： 一种更先进的方法，通过去噪算法识别单核苷酸精度的“扩增序列变体”。ASV比OTU分辨率更高，可重复性更好，是目前的主流方法。

3. 物种注释： 将OTU或ASV的代表性序列与16S参考数据库（如Silva, Greengenes, RDP）进行比对，为每条序列分配一个分类学信息（界、门、纲、目、科、属、种）。

4. 多样性分析：

   · Alpha多样性： 反映单个样本内的微生物多样性，包括物种丰富度（物种数量）和均匀度（物种分布是否均匀）。

   · Beta多样性： 比较不同样本间微生物群落结构的差异。通过PCoA等降维图可以直观地看到样本间的相似或相异程度。

16S测序的优缺点

优点：

1. 成本低： 相比宏基因组测序，成本低廉得多。

2. 技术成熟： 实验和分析流程都非常标准化。

3. 适合大规模筛查： 特别适合进行大样本量的群落结构普查和比较分析。

局限性与注意事项：

1. 分类学分辨率有限： 通常只能准确到属水平，很难达到种水平，更不能区分菌株。分辨率受所选高变区和数据库的影响。

2. 存在PCR偏差： DNA提取效率和PCR扩增效率可能因不同微生物而异，影响丰度定量的准确性。

3. 无法获得功能基因信息： 它只能告诉你“谁在那里”，但不能告诉你“它们在干什么”。要研究功能，需要进行宏基因组测序。

4. 不能区分死菌与活菌： 只要DNA未被完全降解，就会被检测到。

总结

16S rRNA基因测序就像是对一个城市进行人口普查。

· 它不能告诉你每个市民（细菌）的详细技能（功能基因）。

· 但它可以快速、廉价地告诉你这个城市（样本）里主要有哪些民族（属），以及不同城区（样本组）之间的人口结构（群落结构）有何差异。

它是一种强大而高效的工具，是微生物生态学研究的基石，广泛应用于医学、环境科学、食品工业等众多领域。