你能感受到破土而出了么？ 当东方大国还笼罩在肿瘤早筛第一股造假、退市后的阴影之下，美丽国的甲基化测序技术、基于甲基化的多癌早筛（MCED）产品却在最近一个月密集突破。 同一个世界，不同的境遇。 01 中游：Grail，用暴力美学，敲开FDA的大门 大力出奇迹。Grail不仅有大力，而且有巧劲儿。 Grail的多癌早筛产品Galleri，是一款基于ctDNA靶向甲基化测序的产品。
在通过CCGA临床研究进行MCED检测模型建立、Pathfinder 1进行Galleri在真实世界的初步性能测试后，Grail发起了一项规模远超前者的大型前瞻性注册研Pathfinder 2。 这是一项长期随访研究，持续约3年，研究纳入了来自美国、加拿大的 35878 名参与者，覆盖年龄在50岁及以上、无临床癌症怀疑的广泛目标人群。 其目的也很清晰，为Galleri测试获得FDA的上市前批准（PMA）提供决定性的临床有效性和安全性证据，最终敲开FDA的大门。 近期，在2025年10月ESMO上，Grail公布了Pathfinder 2最新结果， 与Pathfinder 1相比，Pathfinder 2结果表现惊人，检测效能显著提升，PPV达到61.6%，组织溯源准确性92%；对所检测的癌症，episode sensitivity提升至40.4%，特异性达到99.6%。
（详见：Pathfinder 2：多癌早筛的新王，你看懂了吗？） 至此，Galleri获批已无悬念，这也将成为首个获 FDA批准的泛人群肿瘤多癌早筛产品。 受此影响，Grail股价又创新高； 一级市场，短短几天，Grail相继宣布与韩国三星集团达成战略合作。三星将向Grail投资1.1亿美元，从而作为Galleri在韩国的独家商业合作伙伴进行业务推广。 10月20日，Grail又宣布获得 3.25 亿美元私募融资。 资本端，真金白银，在用脚投票。 02 上游：甲基化测序正成为测序巨头新的竞争焦点 在方法学上，Grail依然采用了经典的亚硫酸盐转化的方法。 该方法，将DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），经过PCR扩增后进一步变成胸腺嘧啶（T），而原本甲基化的C保持不变，通过测序后对DNA序列的分析区分甲基化状态的不同。
亚硫酸盐转化时间短，虽然速度快，转化效率高，但转化过程中剧烈的温度和pH变化会导至DNA降解和断裂，对DNA的破坏性较大。 为此，多家公司在近期，推出了更温和、简便的甲基化测序技术。我们来看两大巨头Illumina和Roche极具代表性的做法。
作为全球测序市场的领导者，Illumina正试图通过其即将推出的“5-碱基测序”（5-base sequencing）解决方案，巩固自己的竞争优势。 10月15日，Illumina宣布推出全新5碱基解决方案。
不同于传统的甲基化转换技术，Illumina 5-碱基测序技术的核心，在于其专有的转换化学技术，可选择性地将甲基化胞嘧啶（5mC）转换为胸腺嘧啶（T），也最大限度地保留了原始的A, T, G, C序列多样性（高核苷酸多样性）。
这带来一个巨大的好处，它使得在一次流程中，能够同时直接读取A、T、C、G四种常规碱基以及第5种碱基--甲基化胞嘧啶（5mC）。 这改变了过去需要将基因组测序和甲基化测序分两次独立实验的繁琐流程，简化了实验操作，缩短了项目周期，降低了样本的需求量。 更为重要的是，该方法使多模态分析（multimodal analysis）成为了可能，即在一次测序中，同时检测样品的基因突变和甲基化模式，这对提高肿瘤早筛和监测的灵敏度和准确性具有非凡的意义。
One assay，Dual insights。
沉寂多年后，测序巨头罗氏（Roche）携其全新的SBX（Sequencing by Expansion）平台高调回归。
10月16日，ASHG会议上，Roche展示了其SBX平台在RNA测序、甲基化图谱、多组学和空间分析方面取得的重大进展。
Roche SBX是一种基于纳米孔的单分子测序技术。其独特之处在于一种创新的生化转化步骤，即使用被称为“Xpandomers”的分子对DNA链进行化学修饰和扩展。这种扩展后的长链在通过纳米孔时，能产生信噪比极高的电信号，从而提升了测序的准确性和通量，克服了早期纳米孔技术错误率高的瓶颈。
但SBX技术，使用人工合成的X-NTPs替代天然dNTPs来合成Xpandomer分子。这种人工碱基的设计主要是为了增强信号和减少串扰，但同时也改变了原始DNA的化学结构。这意味着，在测序过程中，系统读取的是人工合成的报告基团（Reporter code）信号，而不是原始DNA碱基，可以推测，Roche SBX平台原生甲基化检测能力受限。 但我们在Roche会后发布的新闻稿中注意到一个细节，为了解决这个问题，Roche选择与一家分子酶企业 Watchmaker 合作，将 SBX-Duplex（一种在一次读长中即可连接目标DNA双链的方法）与Watchmaker正在开发的TAPS技术相结合。
（对，就是我们曾经报道过的那家分子酶企业。链接：4个人，一年卖了X千万，但，还是挨批了...） 与Illumina 5碱基测序技术类似，Watchmaker手握一种比亚硫酸氢盐处理更温和的甲基化处理方法--TAPS技术，可以将甲基化C转化为T进行直接测序。 其核心是两步反应： 首先，利用TET酶将5mC和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）氧化成5-羧基胞嘧啶（5caC）；然后，通过硼烷试剂将5caC还原为二氢尿嘧啶（DHU），DHU在后续PCR扩增中会被读取为胸腺嘧啶（T）。
相比传统的亚硫酸氢盐处理，TAPS的整个反应过程对DNA双链结构的损伤非常小。 这带来了多重好处：1）更高的DNA回收率，尤其适用于像循环肿瘤DNA（ctDNA）这样极其微量的珍贵样本 ；2）更完整的基因组覆盖，减少了因DNA断裂导至的测序盲区；3）更低的GC偏好性，数据质量更高 ；4）数据分析流程更简单，计算速度更快；5）多模态分析，可提高肿瘤早筛和监测应用的检测性能。 在ASHG会议上，Watchmaker也宣称，通过大量的酶工程改进以及对相关转化反应条件的优化，5mC/5hmC转化率可达到98%-99%；针对cfDNA和FFPE样本优化后，起始量低至1ng；同时支持包括Roche、UG100等多种测序平台。 篇尾 毫无疑问，2025年的甲基化测序&多癌早筛，正处在一个重要的历史节点。 技术层面，Illumina的5-碱基测序、Roche与Watchmaker的联手，巨头们试图用更简捷的方式，来解决传统甲基化测序中存在的问题。 一套试验流程、同时获取基因组、表观组两组信息，这将会成为甲基化测序领域确定性的趋势。 应用层面，基于靶向甲基化测序的 Grail 终于取得了阶段性成功，我们也即将看到一个多癌早筛临床价值与商业价值完美结合的优秀范本。 新的大门正徐徐打开。 这股强大势能，也终将会流向国内，一扫今日阴霾。 不妨大胆预测一下，在国内， 谁又会率先拔得头筹？ 参考资料： Grail、Roche、Illumina各公司官网 |
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