病原NGS尤其是宏基因组测序（mNGS）凭借无需培养、检测范围广等优点，近年在各种感染性疾病的诊断、新发及突发传染病病因分析等领域大放异彩。但是由于样本中宿主基因组远大于微生物基因组，这种高宿主核酸背景会压倒病原体信号，并降低mNGS检测的敏感性[1]。而具体到宿主去除的实现方案，湿实验和干实验都会涉及，湿实验中面对不同样本类型也有不同操作方法。
在针对细菌、真菌等以DNA为主要遗传物质的微生物时，不同样本中宿主含量差异很大[2]，很多类型的样本原则上是需要进行宿主去除后再进行实验的，这里主要包括核酸提取前宿主去除与核酸提取后宿主去除两大类方案。
核酸提取前宿主去除是针对微生物与宿主细胞的理化性质差别，提前进行分离。主要有两大类：一是基于细胞大小差距，通过滤膜、差速离心、流式等方法分离微生物细胞；二是基于细胞结构，通过差异裂解去除宿主核酸。 核酸提取后宿主去除则是在核酸提取后，通过基因组差别进行分离，包括基于甲基化模式捕获分离以及杂交捕获方案。 综合成本、操作流程和去除效果，目前业内主流方案依然是差异裂解法，基于细菌与人体细胞结构性差异，通过特定方式裂解宿主细胞释放出人源核酸后，再进行细菌、真菌等病原体核酸提取，即可大幅度降低宿主影响。 QIAGEN在原有的去除宿主DNA产品QIAamp DNA Microbiome Kit的基础上，全新推出了QIAamp DNA Host-Free Microbiome Kit！不仅进一步支持包括组织在内的更多样本类型，性能也得到了全面提升，宿主DNA去除效率更高，微生物有效DNA量大幅度提升。
拓展阅读 新学期，装备新升级——你的微生物组样本是否真的做到Host-Free? 如果说宿主DNA去除方式主要集中在提取前，那么宿主RNA去除流程则主要集中在核酸提取后的文库构建环节。原因在于上文提及的许多去宿主方法（如差异裂解、滤膜过滤）主要针对有细胞结构的病原体，对无细胞结构的病毒并不适用，且RNA病毒较为脆弱，轻微的化学物理处理都会影响后续检测。而RNA病毒研究中人源序列极端情况占比高达99.99%，病原体序列仅有 0.01%，去宿主必要性还更高，那该如何操作呢？ 答案就是宿主rRNA（核糖体 RNA）去除！虽然无法去除全部宿主RNA，但是去除提取好的总RNA中占 80%以上的rRNA，已经可以显著降低背景影响，提升检测灵敏度了。来自QIAGEN的QIAseq FastSelect方案仅需一步移液操作，便能将来自于组织细胞、体液等各种类型样本中的人源rRNA和（或）Globin mRNA高效去除，无需任何额外纯化步骤，避免了纯化步骤导至的RNA损失，尤其是针对低起始量体液感染样本的测序研究。除人rRNA去除外，还可提供泛细菌等多种物种rRNA去除试剂，且可以相互结合使用，面对复杂样本也可显著提高病毒RNA检出效率[3]。
拓展阅读 tNGS的技术路线决定前处理策略，对于扩增子 tNGS 而言，只要引物特异性足够好，不做宿主核酸去除也能成功富集目标病原体核酸。而对于基于杂交捕获的 tNGS，答案则是强烈推荐。探针捕获技术虽然也是正向富集，但杂交依然会产生非特异性结合，“捞”上大量的人源宿主核酸。 QIAGEN经典基于杂交捕获的tNGS方案仅需 10 ng 起始样本，内含无需任何操作以及额外纯化步骤的rRNA&Globin去除技术，显著降低人源背景核酸的干扰，减少测序成本的同时降低数据分析难度并提高结果的准确性。现已推出了针对呼吸道病原体、性传播病原体、耐药基因、结核等设计的多款Panel，并支持任意物种的tNGS方案定制，帮助研究人员更快、更准、低成本获取目标微生物的全部基因信息。
在数据分析阶段，基于生物信息学技术也可以将测序数据与宿主的参考基因组进行比对，去除宿主序列。保留未比对的序列作为微生物的数据，进行后续的宏基因组分析。CLC Genomics Workbench提供宏基因组数据分析工具，能够同时完成宿主去除和微生物鉴定，快速准确地分析出可能的微生物。需要注意的是，仅通过生物信息分析去除宿主序列，需要巨大的测序数据量，并且可能会因为数据量不足而遗漏低丰度的微生物，因此在湿实验中进行宿主核酸去除仍是必要步骤。
从样本中检测疑似病原体，本质上是一场信噪比的博弈。宿主是一切实验的目的，也是这场博弈中最大的“噪声源”。 参考文献
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