CRISPR-Cas12b系统在分子诊断领域展现出巨大潜力。与Cas9和Cas12a相比，Cas12b体积更小，更适合通过递送进行基因治疗。Cas12b耐受较宽的温度范围和PH，即使与人血浆在37°C下孵育12小时后，Cas12b仍保持着显著的活性。这些有利的特性使Cas12b成为基因编辑和突变检测中的关键角色。然而，与Cas12a相比，Cas12b仍有可以改进的地方。Cas12a只需要大约42 nt的crRNA就能有效发挥功能，而Cas12b需要大约111个nt的sgRNA。Cas12b对超过100 nt的sgRNA的依赖限制了其精密调控和应用。因此，在保持Cas12b优势的同时增强其性能，在减少其局限性的同时扩展其应用是该领域的一个关键焦点。 近日，杂志Nature communications上发表了一篇题为“Regulating cleavage activity and enabling microRNA detection with split sgRNA in Cas12b”的文章。研究团队提出了一种分裂sgRNA策略，通过将sgRNA拆分为通用组件（如tracrDR或tracrRNA+DR）和可替换的Spacer区域，实现了对Cas12b活性的动态调控，并扩展了其检测功能，包括直接检测microRNA等小分子核酸。
图片来源：Nature communications 主要内容 Split sgRNA设计 作者将传统sgRNA拆分为两部分（tracrDR+Spacer）或三部分（tracrRNA+DR+Spacer），其中DR（直接重复序列）为通用短序列（11 nt），Spacer（18–23 nt）可定制化替换以靶向不同核酸。短的通用DR片段（11nt）易于人工合成和化学修饰，可以通过DR的不同修饰和去修饰来精确调节Cas12b的活性。Spacer的长度与microRNA相似，这为用microRNA代替原来的Spacer来指导Cas12b的裂解活性开辟了可能性。 实验证明，分裂结构保留了Cas12b的顺式和反式切割活性，且反式切割效率与全长sgRNA相当（下图d）。分析结果显示，全长sgRNA与Cas12b形成最稳定的复合物，具有最高的结合亲和力和最佳的切割活性。分裂形式虽然显示出降低的结合亲和力，降低顺式裂解活性，但仍保持显著的反式裂解活性。
Split sgRNA设计。图片来源：Nature communications 通过替换Spacer来检测各种核酸靶标的通用策略 作者设计并合成了针对EBV、MPXV和HCV的不同Spacer，并结合通用的tracrDR或tracrRNA+DR系统检测不同核酸靶标。结果表明，tracrDR+Spacer策略非常有效，EBV、MPXV和HCV的检出限（LOD）分别为3.18、3.09和12.4 pM（下图e）。同样，tracrRNA+DR+Spacer策略，EBV、MPXV和HCV的LOD分别为15.9、5.35和16.4 pM（图c-e）。
替换Spacer来检测各种核酸靶标的通用策略。 图片来源：Nature communications 对DR区域的修饰可精确调节Cas12b活性 . 分裂sgRNA （tracrRNA+DR+Spacer）中的DR区是最短的通用序列（11 nt），为了实现对Cas12b切割活性的精确控制，作者利用乙二醛（glyoxal）修饰DR区域可暂时抑制Cas12b活性，在60°C下加热5分钟后Cas12b的反式裂解活性逐渐恢复，40分钟后功能完全恢复（恢复率>96%）。 作者还尝试了Cas12b的光控激活。在DR区域连接光裂解（PC） linker和随机DNA序列（DR-PC-DNA），可以有效地暂时抑制Cas12b的活性，接着通过UV照射（365 nm, 15秒）释放活性DR。通过将RPA-CRISPR- cas12b系统与DR-PC-DNA结合，作者开发了一种基于DR-PC-DNA的光控单管式RPA - CRISPR-Cas12b核酸检测系统。DR-PC-DNA抑制Cas12b的切割活性，防止对RPA的干扰。RPA过程完成后，应用15秒UV照射恢复Cas12b的裂解活性，使荧光信号的收集成为可能（图f）。使用这种方法，临床血浆中EBV的检测灵敏度与传统qPCR相当（LOD达3.18 pM）（图g）。
对DR区域的修饰可精确调节Cas12b活性。 图片来源：Nature communications MicroRNA可替代分裂sgRNA策略中的 Spacer进行直接检测 Spacer的长度与microRNA的长度相似，因此microRNA可以取代分裂sgRNA中的Spacer区域（tracrDR+Spacer或tracrRNA+DR+Spacer），从而保留Cas12b的功能。设计合适的DNA激活剂来靶向特定的microRNA，可直接检测microRNA而不需要逆转录或扩增。作者设计了结直肠癌的潜在生物标志物miR-21、miR-17、miR-31和miR-92a的相应激活子，，并验证上述假说。研究结果表明，只有特定的microRNA能有效地与tracrRNA、DR（或tracrDR）和Cas12b形成复合体来识别对应的激活子，并激活Cas12b的反式切割活性，释放荧光，有很高的特异性。miR-21、miR-17、miR-31和miR-92a的检出限分别为26.7 fM、37.2 fM、33.5 fM和28.9 fM ，可使用商业CRISPR试纸条可靠地进行检测。 作者还将这种检测方法成功应用于结直肠癌细胞（HCT116/SW480）和患者血浆样本中，进行miR-17/21/31/92a的定量分析。结果表明，健康个体的microRNA水平低于结直肠癌患者术前水平（图i），检测结果与传统RT-qPCR的结果非常吻合（图j）。
MicroRNA可作为分裂sgRNA策略中的Spacer进行直接检测。 图片来源：Nature communications 总结与讨论 作者提出了一种针对Cas12b的分裂sgRNA策略，将传统sgRNA拆分为两部分（tracrDR+Spacer）或三部分（tracrRNA+DR+Spacer），其中DR（直接重复序列）为通用短序列，Spacer可定制化替换以靶向不同核酸。分裂sgRNA保留了引导Cas12b顺式和反式切割活性的能力。DR片段易于人工合成和化学修饰，可以通过DR的不同修饰和去修饰来精确调节Cas12b的活性，并确保与重组酶聚合酶扩增的兼容性。分裂Spacer的长度与microRNA相似，microRNA可以取代Spacer，无需逆转录或扩增即可直接检测。在来自健康个体和结直肠癌患者的培养细胞和血浆中，该方法产生了与RT-qPCR一致的结果。 这种方法的局限性在于分裂的sgRNA对Cas12b的亲和力降低，降低了顺式切割效率，限制了其在需要强顺式切割的应用中的应用。对于痕量临床样品敏感性也不十分理想，需要与等温扩增方法相结合。最后，对通用DR进行小分子修饰以精确调控Cas12b活性增加了实验的复杂性和成本，这一挑战可以通过修饰RNA组件的未来商业化来缓解。未来的研究将集中在进一步优化该临床评估平台，并探索其与更广泛的诊断工作流程的整合。 |
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