从多步到单管：CRISPR一锅法能为分子检测带来哪些新突破？

为什么需要“一锅法”检测？

PCR技术凭借其高灵敏度与特异性成为核酸检测的行业金标准。但检测耗时长、依赖复杂检测设备及专业人员等问题限制了其在资源受限地区、家庭自测场景下的应用。这不利于核酸检测技术走向基层、走入家庭。

等温扩增技术在单一温度下即可实现病原核酸检测，无需依赖大型设备，解决了PCR技术便携性不足的问题。但等温扩增技术特异度低的性能问题也限制了其大规模的应用。

CRISPR诊断技术诞生后，单独使用CRISPR检测虽具备无需扩增、便携性高的天然优势，但其飞摩尔级（fM）的检测限尚难以完全满足临床检测需求。

科学家将等温扩增技术与CRISPR技术结合。通过等温扩增技术对靶标核酸进行扩增，再结合CRISPR技术对检测信号实现二轮放大，提升检测灵敏度。

同时，CRISPR技术自身的高特异性，也有效降低了检测体系的假阳性率。二者优势互补，加之均具备无需依赖复杂设备的特点，逐步成为CRISPR诊断技术研究中的核心方向。

将这一技术策略放在整个核酸检测体系中，这一技术体系最需要解决的现实问题是什么？

qPCR技术解决了检测准确性的问题、dPCR技术进一步提升了检测性能并解决了绝对定量的问题、NGS解决了检测通量、检测靶标数量与突变检测等问题。但是，以上技术策略均需要依赖复杂设备或实验流程。

相比之下，等温扩增 + CRISPR的技术策略的核心优势应当放在：保证检测性能的同时，最大限度提升检测便携性。

但是，最初，此检测技术需分步进行等温扩增与CRISPR检测，等温扩增步骤结束后需手动添加CRISPR体系，流程便捷性不足且存在污染风险。

SHERLOCK, DETECTR 及 HOLMES 等成熟CRISPR检测系统将扩增与CRISPR检测整合为单一无缝流程，可在单一温度条件下运行并满足临床检测性能要求，成为当前CRISPR检测研究与应用中的主力军。

尽管以上平台应用前景广阔，但仍需依赖多步操作、复杂试剂，并存在污染风险。为了解决以上问题，“一锅法” CRISPR检测技术应运而生，并成为近年来CRISPR检测中的研究热点。

什么是“一锅法”检测？

“一锅法”检测将核酸扩增与CRISPR检测在密闭单管反应容器内同步完成，该体系将必要的生化反应集中在一个管腔中，免去开盖、移液或转移等人工干预操作，显著降低了污染风险、缩短了检测时间，更适用于POCT应用场景。

“一锅法”检测的问题与解决思路

目前“一锅法”检测策略中面临的主要技术问题包括：

（一）温度兼容性问题

不同等温扩增技术策略对温度要求不同，如：LAMP环介导等温扩增技术需在60-65℃下进行扩增；RPA重组酶聚合酶扩增技术需在37-42℃进行扩增。

同时，不同Cas酶发挥切割活性需在特定温度下进行，常见Cas酶的最佳活性温度要求如表1所示。

等温扩增与Cas酶对温度要求的差异，决定了一锅法中两种技术的搭配策略，如：Cas12可搭配LAMP及RPA，Cas13更适合搭配RPA扩增技术等。

近年来，多种耐热型Cas12及Cas13酶的发现，使Cas酶逐步适用于高温检测环境，适配性进一步扩大。

表1 不同Cas酶最佳温度活性要求

（二）体系间互相干扰问题

等温扩增与CRISPR检测体系混合后可能产生检测体系间的互相干扰，例如：

• RPA扩增过程中产生的扩增模板DNA可能与CRISPR检测体系中的crRNA特异性结合，启动Cas蛋白的顺式切割，可能造成RPA扩增模板丢失，影响检测效率。

• Cas12在特异性靶标识别后会启动反式切割活性，切割体系中的ssDNA，此时，RPA扩增的单链引物也可能被切割，从而降低等温扩增的效率。

  
  

以上干扰会降低检测体系的灵敏度，影响检测性能。

为避免以上干扰，科学家已提出了以下几种策略：

1、时序分离策略

即通过一定手段控制检测体系中CRISPR切割过程，使其在等温扩增反应后进行。

例如：

可通过修饰crRNA或设计与crRNA特异性结合序列，从而暂时抑制或沉默Cas酶活性。在扩增反应充分后，通过光照解除抑制或通过RPA扩增产物的释放来解除抑制，从而启动后续CRISPR检测步骤。

2、设计次优PAM或无需PAM的crRNA

crRNA与Cas酶复合体启动顺式切割活性时需依赖PAM识别（以Cas9, Cas12为主），标准PAM序列激活Cas蛋白的能力较强，因而通过顺式切割造成扩增模板丢失的概率更大。

次优PAM设计或无PAM crRNA设计可减弱Cas酶的顺式切割活性，降低等温扩增模板的丢失率，加速扩增产物积累并可激活后续Cas12反式切割功能。

3、检测系统组分优化

通过精确调控除crRNA及Cas酶外的其他反应组分及其浓度，来实现提高系统兼容性、调整检测时序性的目的，进而提升检测性能。详细可参见文献[1]。

4、空间分离策略

即将等温扩增和CRISPR反应分别在不同的空间中进行，但仍保持二者功能关联，从而尽量避免二者反应体系的干扰。

主要有刚性分离和柔性分离两种策略。刚性分离可通过微流控系统或定制装置使两个反应体系空间隔绝，扩增反应结束后联通进行CRISPR检测。柔性分离系统实现物理隔离的同时，利用半透膜、水凝胶等界面来实现分子转移，从而实现两个检测体系的延迟融合，增加扩增反应的效率。

总结

总之，尽管“一锅法”检测仍面临以上技术难题，但已有大量科研文献为“一锅法”的技术难题提供了可行方案。

目前，“一锅法”CRISPR检测平台已有应用于细菌、病毒、寄生虫、转基因作物及疾病生物标志物检测相关的研究，并在近几年成为CRISPR检测研究领域中的热点。

回到等温扩增 +  CRISPR检测技术策略要解决的核心问题：保证检测性能的同时，提升检测的便携性，助力核酸检测POCT化，助力产品走入资源受限地区、走向家庭自测领域。

随着检测试剂成本的不断降低， 基于CRISPR的“一锅法”检测将可能是解决这一核心问题的主要思路之一，也可能成为未来高灵敏、高便携核酸检测新的方向。

参考文献：

[1] Li X, Liu J, Wang R, Fu H, Kim M, Li X, Peng W, Man S, Gao Z, Ma L. CRISPR-based one-pot detection: A game-changer in nucleic acid analysis. Biosens Bioelectron. 2025 Jul 14;288:117786.

[2] Hu F, Liu Y, Zhao S, Zhang Z, Li X, Peng N, Jiang Z. A one-pot CRISPR/Cas13a-based contamination-free biosensor for low-cost and rapid nucleic acid diagnostics. Biosens Bioelectron. 2022 Apr 15;202:113994.

[3] Lin M, Yue H, Tian T, Xiong E, Zhu D, Jiang Y, Zhou X. Glycerol Additive Boosts 100-fold Sensitivity Enhancement for One-Pot RPA-CRISPR/Cas12a Assay. Anal Chem. 2022 Jun 14;94(23):8277-8284. doi: 10.1021/acs.analchem.2c00616.