mNGS与tNGS原始列表，您用对了吗？
2025-6-17 09:36|
编辑: 归去来兮|
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摘要: 当tNGS到来后，这一原始列表查询需求也被迁移到该技术路线上。
Hello, All Pathogens!
新说| 人体微生物
mNGS的应用“倒逼”部分临床医生养成了一个习惯——溯源原始列表。即当有病例疑似与临床诊断不符或有其他病原学证据指向与mNGS不符时，他们便会要求查询原始列表，再次筛选是否存在被解读人员漏报的病原体。当tNGS到来后，这一原始列表查询需求也被迁移到该技术路线上。然而在拿到原始列表后，专家们产生了更多的疑惑，例如原始列表中有这么多病原体，为什么你们就报告这几种？为什么原始列表有鲍曼不动杆菌10条，血培养都阳性了你们没有报告？这个患者怀疑真菌感染，原始列表中黄曲霉有1条，为什么不能加到报告里面？如果大家对原始列表的形成过程、关键参数、当前mNGS与tNGS的报告解读逻辑，以及查询原始列表的获益与局限性等了解得很清楚，那么查询原始列表也不是谁的特权，解读人员也不必纠结，直接提供原始列表，让专家自行查询、自行解读即可。但是，作为读者的您应该也感受到了，上面的大前提假定太多了。如果一切这么简单，也不会有今天这篇文章的切入了。本身mNGS也好，tNGS也好，是一项相对复杂的检测技术，涉及的检出病原很多，又面对试剂、仪器、实验环境多方面引入的背景干扰与样本自身以及样本间交叉污染带来的影响。它们本地化、走进临床，面对着千万个对技术了解深度不同的检验专家和临床医生。让大家都会使用原始列表，着实也是一件难事。难归难，该做的培训，该提醒的要点还得做。毕竟水滴石穿，铁杵也能成针。笔者将在本章初步阐述mNGS原始列表查询的成因、正向获益与负面影响、不同NGS技术原始列表查询时的注意点，期待检验专家与临床医生不被原始列表中的病原呈现所误导，也不要遗漏真正值得关注的病原，恰当地使用原始列表，应用该技术辅助诊断。在正文开始前，笔者再唠叨一句，如果您不是特别了解病原NGS技术，同时您诊治的患者其他病原学依据相对缺乏时，请一定审慎使用病原NGS原始列表，与检验方充分沟通关注病原报告与不报告的原因与考量点。强烈不建议仅基于原始列表中怀疑的病原，进行诊断用药。原始列表最早伴随mNGS而生，是下机数据分析后可视化的数据表格，也是正式报告的前身。正式报告的病原源自于它，但不完全等于它。作为其子集，相比于原始列表中动辄几百，多则可达上千条的病原体列表，正式报告经过初步的自动化逻辑判断和报告解读人员的审核，更加精简、可读和准确。原始列表比正式报告复杂在两个方面，一方面体现在疑似病原体数量庞杂，另一方面体现在其包含更多的专业参数。比如会有报告一般不会呈现的覆盖度、序列比对相似度、非特异性比对序列数等。mNGS应用起初，报告解读人员的工作本质便是面对一份份原始列表，从中筛选出疑似的病原菌并报告。不过发展到现在，他们不再需要耗时耗力地手工进行病原体挑选、一份份的“手搓报告”。基于临床经验与大数据的加持设置的自动化报告逻辑，外加实用的解读小工具已经逐步将他们解放出来，从原来一份份的手工报告逐步转向以审核为主的工作内容。回答上面这个问题之前，先问一个问题。既然专家们有原始列表查询需求，为什么不开放原始列表，让每一份报告都随附一份原始列表呢？这在很大程度上源自于mNGS技术的复杂性。复杂性体现在原始列表“鱼龙混杂”，识别疑似致病病原的技术要求与专业知识要求壁垒很高。比如以我们现有的医学常识来讲，通常血流感染的病原体是一种或多种病原体，这个“多种”一般也不会超过3种。那典型的原始列表有多少个微生物呢？有成百甚至上千个。这种情况下，如何进行报告解读呢？前述章节我讲了基于种/属序列数、属种排位、检出病原标准化序列数与阴性对照标准化序列数的比值等等，设定阈值来进行报告。另外一方面，报告解读人员也需要懂mNGS技术，懂微生物，还得懂部分检验、临床知识，才能更加准确地将报告发放出去。随附原始列表发放，不仅对千万个使用该技术的临床医生起不到指导提示作用，大多时候反而变成了信息负担。当然，一旦设置阈值，便不可避免有灰区的存在。比如伯克霍尔德菌属细菌是常见的NGS背景菌（前处理、提取&建库试剂等可能引入，后续章节再谈），几乎每一份样本都能找到伯克霍尔德菌属细菌的痕迹。因此除洋葱伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌外，其他伯克霍尔德菌属细菌如稳定伯克霍尔德菌、多噬伯克霍尔德菌等序列数较低时会被纳入到背景菌数据库，不作报告。绝大部分情况下，这样的规则可理解也合理。因为一方面，此类试剂背景菌导至的临床感染很罕见。另外一方面，即使患者感染了此类试剂背景菌，当超过预设的基线时也可以被识别和报告。但一切都不绝对。笔者曾遇到过临床培养出来了多噬伯克霍尔德菌，查询原始列表因其为背景菌未报告的情况。此时，该菌是背景菌还是致病菌，像真假美猴王一样难辨别。报告解读人员也很难去敲定这个菌到底是试剂还是样本来源。因此为了避免误导临床，大多此类背景菌的报告就会偏保守一些。笔者认为这也是mNGS当前最大的挑战（请注意没有用之一）。不过，去年已经有检测单位部分攻克了这个难题。他们借用生物信息学与大数据分析的力量，从检出微生物的基因组层面来一定程度区分特定背景菌，比如鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌等是试剂背景引入还是临床样本来源，铜绿假单胞菌是实验室环境来源还是样本来源，为更加准确地进行mNGS报告提供了技术支持。从理论到技术实践成真，成为了mNGS行业进展的一大步，精准感染诊断行业的一小步。不过，生物信息分析虽然解决了一部分常见背景菌的识别问题，但仍面临着向更多背景菌（比如上面案例中的多噬伯克霍尔德菌）扩展的艰巨任务。其次，生物信息学分析，前提是需要更多的信息输入量，例如较多的序列信息。也就意味着与高敏的检测技术搭配，才能发挥其识别优势。如果检出仅有几条特异性序列，它们静静地躺在原始列表中，报告解读人员也说不出个所以然。如笔者前述章节提及，mNGS的阈值尚未完全标准化，还在经历临床导向下的反复打磨。在打磨的过程中，临床也了解到，对于少数案例，会存在原始列表中存在疑似致病菌，但是没有报告的情况。而且mNGS的发展过程较为特殊，最先通过临床广泛应用证明其价值所在。所以临床医生遇到部分案例不符时，第三方检测机构直面临床答疑解惑，部分宣教了原始列表的价值。逐步应用过程中，对于疑似不符病例，部分临床医生开始索要原始列表查询，甚至部分了解技术的医生开始担任起自我进行报告解读的工作。考虑到mNGS阈值设置的复杂性，以及检验技术灰区的存在，查询原始列表的方式，对少数病例的精准报告的确起到了积极作用。比如患者血培养大肠埃希菌阳性，而同一份mNGS没有报告大肠埃希菌，反而报告了肺炎克雷伯菌等其他病原。查询原始列表，发现大肠埃希菌特异性序列有1条，报告解读人员因序列数低于3条这一普遍标准并未报告大肠埃希菌，而报告了序列数更高的肺炎克雷伯菌。或患者肺泡灌洗液样本荧光染色曲霉菌阳性，同一份肺泡灌洗液样本mNGS阴性。临床查询原始列表，发现该样本检出烟曲霉2条，同时阴性对照检出烟曲霉1条，报告解读人员因该样本烟曲霉序列数较低，且阴性对照检出1条未报告。在同一份样本有明确的其他病原学证据的情况下，通过查询原始列表，mNGS的低序列结果得以确认。这也帮助临床再次确认病原学，打消了不同方法学不一致的顾虑，增强了诊断信心。对检验或者第三方机构来说，临床反馈与沟通让原始列表中的灰区结果闪现价值。查询原始列表并非一定都是正向获益。笔者也曾遇到多次过度使用原始列表的情况。比如患者怀疑感染，但病原学依据缺乏。送检mNGS后依旧是阴性，但查询原始列表后，临床坚持认为某低序列背景菌是疑似病原，要求修改报告。在反复沟通过程中，笔者调取历史大数据、当批次结果等多项数据作为支持，强调该菌背景来源的可能性以及报告风险。这其中的过程，有些达成一致，互相理解，有些并未成功。当然，临床医生或者第三方机构的坚持，并不代表着对方“不正确”，因为部分患者疾病精准诊断太难，太有迷惑性。还有一些病例的病原学依据，比如G实验并不一定等同于真菌感染。导至G实验假阳性的因素有很多，比如用药、使用医用纱布等。这种时候，带着这种相对可靠度不高的依据去查询mNGS的原始列表，可能会走向“歧途”。总之，原始列表会因阈值设置的局限性有漏报可能，但原始列表也是各类“背景菌”齐聚的迷乱之地。我们一定要睁大眼睛，本着严谨、求真的精神来审视原始列表。查询原始列表的负面影响在于临床医生在繁杂的工作中，对mNGS技术的了解相对有限，同时掌握的信息相对有限（比如不了解阴性对照检出情况、不了解同批次其他样本检出情况、不了解近段时间的实验室检测情况等），原始列表中的真假病原菌会对临床医生的感染诊断产生负面干扰。从产品设计层面考量，tNGS是靶向测序技术，靶向检测到了就报告，没有检测到就不报告，也就不涉及原始列表这一事宜，医生也不需要追问tNGS的原始列表。不过，实际情况却与我们的理解有所出入。一方面，mNGS的市场教育让医生把原始列表的需求迁移到相似的tNGS产品上。另一方面，查询原始列表确实有少数病例可以找到灰区的报告结果，通过其他病原学依据的印证而诊断获益。但是，对于tNGS的原始列表查询，笔者有两个要点需要阐述。其一，不管是扩增子技术路线的tNGS，还是探针捕获技术路线的tNGS，它们都属于正向富集技术，灵敏度都会显著高于经典mNGS技术。此时，我们需要考虑高敏感性带来的负面效应，比如背景菌的信号放大。因此，它们的阈值设置会普遍高于经典mNGS的阈值设置。那假如您遇到tNGS原始列表中，大肠埃希菌竟然20条都没有报告，铜绿假单胞菌竟然100条都没有报告，那也不必惊讶。其次，对于扩增子技术路线的tNGS原始列表，笔者建议使用时一定要慎重。对于该技术路线的挑战笔者在tNGS阈值设置章节有谈及。所以临床拿到的tNGS原始列表混有较多同批次其他样本的病原、非特异性扩增的病原，这些都会干扰“不知情”的您进行诊断。如果作为临床医生的您，仅基于看到某一份样本的原始列表来做决策，可能会因为没有看到其他样本对该样本潜在的影响而忽视样本交叉污染，可能会因为没有看到阴性对照而忽视背景检出干扰，可能会因对物种同源性扩增误差而误识疑似病原。在信息相对缺乏的情况下，这些会导至您的判断出现一定误差。因此，如果临床送检病例的其他病原学证据缺乏或患者的临床表现不典型，单一一份样本的原始列表可能会具有误导性。建议您审慎使用原始列表，在原始列表里面找结果的方式不可取。病原NGS的阳性率与什么因素相关呢？除了与是否去宿主、去宿主强度、核酸提取效率、建库效率、测序数据量、比对mismatch设置等干湿实验相关外，最终也取决于阈值设置的高低。在病原NGS经验导向性下已经形成了一些通用认知的阈值。经验导向性下的阈值也意味着一定程度的局限。比如各检测单位的经验性阈值就会存在较大差异，有些检测单位偏保守，宁可假阴性也不假阳性。有些检测单位偏激进，低序列的都会展示在报告上提示临床。也就是说，报告策略一定程度决定阳性率，当下各检测单位产品临床表观体验带来的质量差异，部分原因也可以追溯到报告解读人员专业性差异以及报告策略的差异。比如笔者近期遇到的两家检测单位的PK案例，两个样本A家除了检出与B家共用的病原外，还比B家多检出了两个真菌，一个样本是黑曲霉，一个样本是镰刀菌。那是不是A家就更敏感呢？临床后续告知了答案，虽然患者都来自于血液科，但更倾向认可B家的结果，一方面患者首先不倾向于真菌感染，而B家多检的大肠埃希菌更加符合临床。回溯原始列表，会发现B单位其实也有低序列对应的真菌，但B家基于阴性对照以及历史大数据，认为其背景来源可能。所以两家的结果差异在哪里？除了大肠埃希菌检测性能上的差异，也在于报告策略上。A家面对特定的群体报告更激进去靠近临床，而B家相对更理性保守一些。当然，也不排除B家可能因为灰区漏报病原的可能。而这时候，基于临床诊断的信息反馈与沟通就非常重要了。因此，各病原NGS单位之间的较量，是产品性能的较量，也是报告解读人员专业性的较量，更拔高一点，是检测单位愿景与使命的较量。这些也同样考验着检验专家和临床医生，要去识别和甄选。这也意味着，不得已的情况下，专家们要回溯原始列表，除了样本本身以外，要看更多的数据，也要与检验单位充分沟通报告与不报告的缘由。笔者最后想说，迎合会在特定情况下获益，但长久来看，坚守初心不会错。如果接下来有一些病原NGS检测单位宣称自己检测产品性能很好，阳性率100%等类似的话语，对于这种不着边际的宣称，我们一起来“骂醒”他们！写这一篇文章让我很纠结，很忐忑。揭露了一些东西，谈到了mNGS与tNGS原始列表查询所引发的负面信息。但是回想过来，病原NGS有那么多优点，如病原体覆盖广泛、阳性率高、时效性高、还可以检测耐药/毒力基因、检测少见、罕见以及新发病原。如果它是一个特别完美的技术，反而有点不真切了，毕竟我们都知道“硬币有两面”，辩证看待事情方可走的更远。当下，mNGS在终端价格比tNGS贵一些。笔者认为，除了检测成本、病原范围以及部分病原的性能差异外，其实也溢价在产品打磨优化过程中的经验累积、报告解读专业性、整个检测单位团队专业性层面。行业的朋友们，病原NGS的路已经越来越清晰，虽然路途上还横亘着背景菌这样的“大石块”，我们一起移开它，加油！
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