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新说| 人体微生物
上一章节我们尝试回答了mNGS的阈值（cut-off）问题，本章我们将视角拉回到tNGS。tNGS虽为靶向测序技术，但与mNGS有许多相似之处。它如何设定阈值呢？不急，我们慢慢来探讨。前述章节我们谈到tNGS技术有两个流派，一派是成本更低的扩增子技术路线，一派是成本更高的探针捕获技术路线。扩增子技术路线当前应用更加广泛，在阈值设置上与mNGS差异较大，笔者先从扩增子tNGS的阈值设置谈起。tNGS方向最早发表的一篇系统性共识是在分枝杆菌病诊断领域。关于扩增子路线的阈值标准有一大段话描述，我们逐一来剖析。其中第一句话“由于靶向测序采用的是扩增分枝杆菌多靶点分类基因的方法，判断标准不同于mNGS检测。特异性序列大于100条序列，且非单一靶点序列，可推荐作为阳性阈值判定标准”。从这句话中，我们看到两个关键信息：“100条序列”和“非单一靶点序列”。两个信息告诉我们什么事情呢？第一，tNGS 阈值比 mNGS 结核分枝杆菌当前普遍认可的 1 条序列数阈值高。另外，这 100 条阈值的设置大概率基于临床实践经验。第二，“非单一靶点序列” 要求检出的序列来自多个位点，即单一位点的扩增不可靠，对序列扩增的多样性有要求。紧接着第二句话“特异性数据小于100条序列，特别是同批次有获得大量序列数支持结核病诊断的标本时，需行其他方法学进行佐证，可进行实时荧光定量PCR确认”。这句话，同样传递出一个关键信息。即同一批次有高序列分枝杆菌检出的样本时，其他样本会受到影响。说白了，会受到高序列阳性样本的影响。影响了怎么办呢？答复需要对于相对偏低的序列数区间（10-100条），需要PCR验证。第三句话“特异性数据小于10条序列时，尤当慎重判读，建议考虑另留取一份样本进行检测以佐证本次检测结果。如重复样本获得阳性结果，无论序列数如何，都应首先考虑其结核病诊断；如果复测结果为阴性，则暂不考虑其结核病诊断”。传递出来的关键信息是低序列的检出要另取样本检测。潜在意思是低序列的检出情况下不排除这个样本被高序列的样本或者其他原因污染了，原样本复测价值不是很高，或者此时因序列偏低PCR已经验证不出来了，要重新取样。其实这个共识对mNGS的阈值也提了一句“《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》建议，对于结核分枝杆菌等具有临床重要意义且较难检测的病原菌，检出1条特异性序列即可判断为阳性。鉴于检测的复杂性，本共识建议对获得个位数的序列首先审核当前批次检测中有无其他获得大量序列支持结核病诊断的标本”。潜在意思是说，不管是mNGS还是tNGS，病原体含量高的样本会干扰同批次其他样本。这是不争的事实，这一方面源于样本检测过程中的湿实验污染，一方面也可能源于测序平台引入的index-hopping(后续章节再叙)。那为什么在扩增子tNGS共识中把这一问题重点拎出来说呢？当然是，这个影响因素非常重要而且关键，不说清楚，结果就不准确了。其实如tNGS黑与白章节谈及的一样，扩增子tNGS的优势在于价格、敏感性，但缺点就在于特异性。它的关键环节就是经过一轮或两轮PCR，使得含有靶标的片段大量扩增，所引发的气溶胶污染就令人抓狂了。所以从该共识的描述中，相比于mNGS，不管是设置较高的阈值也好，要求多个靶点扩增也好，较低以及低序列样本要进行PCR验证或重新取样本也好，都是识别、降低与消除污染影响的手段。从这些信息中，我们也得到了扩增子tNGS解读报告的关键点。即当污染很难防控的时候，需要通过较高的阈值或第三方验证来确保检测的可靠性。除了上述提及的针对分枝杆菌阈值报告原则外，mNGS和tNGS在其他病原体的阈值设定异曲同工之处非常之多。另一篇tNGS共识中这么描述“目前尚无统一的、公认的阳性判读标准，实验室可根据方法学建立时确认的阳性阈值确定原则，确立不同病原体阳性检出的阈值，并持续调整和优化。不同检测体系中微生物类型的检出可能存在差异，需分别建立阳性阈值,如可根据革兰阳性菌、革兰阴性菌、丝状真菌、酵母菌、DNA病毒、RNA病毒、寄生虫及特殊病原体分别确定阳性阈值”。与笔者上一篇mNGS阈值提及的不同类别的微生物要差异化设置阈值意见相近。还有一篇共识描述“试剂工程菌、背景环境菌、环境中的气溶胶可能导至假阳性结果。建议通过生物信息分析建立试剂和环境的基线数据库，以提高检测准确性和可靠性”，这也与mNGS的解读逻辑相近。不管是mNGS，还是tNGS，都逃脱不了从前处理开始，试剂、环境、操作等各方来源的背景微生物的干扰。因此，两者都需要对于背景干扰的微生物要建立试剂和环境基线数据库，包括阴性对照基线和历史检测基线。无非是这个阈值会如前所述相较于mNGS的阈值偏高（具体因病原体而异）。谈到不同点，还是要回归到技术底层。两个技术最大的一个差异在于宿主是否对检测结果产生影响。对于mNGS来讲，宿主是一个绕不开，甩不掉的包袱。宿主率高的样本，会干扰疑似病原菌的检出。因此，一方面，湿实验环节，mNGS会有前置的去宿主流程来降低人源宿主干扰。另一方面，在mNGS报告时，解读人员还会对临床确诊的、但mNGS阴性的样本或对处于阈值报告灰区的样本进行宿主比率维度的评估，来判断是否因极高宿主占比，而对检测结果产生影响。而对于扩增子tNGS来讲，它是靶向目标病原的正向富集技术，理论不受人源宿主的影响。湿实验部分也不需要进行最起始的去宿主环节，其对特定的低载量病原具有更高的敏感度。因此，阈值的设定过程中，面对不同宿主含量的样本类型，是否考虑宿主因素是两者差异之一。当然，多讲一句，对于扩增子tNGS来讲，虽然没有宿主层面的干扰，但测序数据中占比较高的引物二聚体会降低测序数据的有效率，与mNGS中宿主产生的干扰类似。其次，扩增子tNGS属于有限靶标的检测技术，也就意味着靶标外的病原检测不到。因此mNGS阈值设定时考虑的两个关键参数，属内排位与相对丰度对tNGS来讲就失真了，可参考意义相对有限。举个例子，假设样本中有流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌两种，扩增子tNGS仅针对流感嗜血杆菌设计了引物。那原始列表中看到的情况可能是，嗜血杆菌属仅有流感嗜血杆菌的检出，那据此看到的流感嗜血杆菌的排位以及相对丰度就不准确了，因为副流感嗜血杆菌未被纳入，此时失真的参数就不能用于报告解读阈值设置了。综合实践经验，相比于mNGS，笔者认为当前扩增子的tNGS的阈值设定挑战较大，需要行业革命化的技术突破来解决。为什么呢？因为即使在临床前研究明确了阈值，扩增子tNGS最大的难点是外界动态因素如同批次一起检测的临床样本、实验室环境变化等方面的影响，使得其预设好的阈值出现较多的灰区。不得不如共识提及的一样，要PCR复测，要重新取样。这个观点也如较前段时间中检院对国内各单位tNGS技术质量评价联合研究一样，即“比较tNGS与mNGS的阴性符合率发现，mNGS的假阳性多因背景微生物干扰，而tNGS的样本交叉污染问题更突出”。再往前推一步，动态因素一方面体现在实践过程中，该技术所需的上机数据量较低，同一张芯片上机的样本数目更多，理论可达数百个。此时未明确病原的样本会相互间带来更多的不确定性。其次，含有高载量病原的样本核酸片段会通过PCR扩增实现瀑布式的信号放大，产生的气溶胶污染令人烦忧。尤其面对重要病原如结核分枝杆菌、曲霉菌或在特定病原的高发季，如肺炎支原体，甲型流感病毒暴发时，此类问题更为凸显，亟待解决。外界动态因素的引入会让预设的阈值失效，或者预设的阈值过高导至灰区较大。那如何应对呢？如共识提及的一样，引入可靠的验证很重要。所以把扩增子tNGS与可靠的PCR产品联合是一种应对方法。当结果受到交叉污染影响时，灰区的病原检测结果再用PCR技术验证更为妥当。这种情况下，相当于扩增子是一个前置的“筛查”检测，后续的PCR“验证”检测再来加持确认（可能这种描述不太精准，请见谅）。当然，一方面PCR验证会带来一定的成本、人力投入以及2-3h报告时长的增加。另一方面，PCR产品与NGS产品针对不同病原体的检测限不同，NGS较低序列用PCR验证，或PCR弱阳性用NGS检测，互相都有可能验证不出来彼此有优势的检出（这里有一个很大的命题，PCR比NGS更灵敏吗？后续章节我们再议）。不过面对大批量样本检测时，验证需求较为迫切，在检测方有完善配套的PCR验证体系下进行验证，可以满足大部分“假阳性”与否的验证需求，进而负责地交出一份可靠的检测结果是我们共同的初心所在。另一方面，从实验环节入手，比如定期及时的消毒通风，超净工作台分样本类型进行提取、PCR扩增区的单独设置，甚至技术性革命直接两轮扩增变为一轮扩增，这些都会带来一定的改善，笔者就不过多赘述了。在见证数万例扩增子tNGS报告过程中，写下这个事实的时候，内心还是有点忐忑的。因为这么讲出来，作为行业从业人员，似乎在抨击扩增子tNGS这个百万检测量的既定事实。污染问题既然那么要紧，市场接受度却这么高，是不是与事实相悖？我想，也没有。虽然扩增子tNGS污染问题亟待解决，但架不住它性价比高，可以普惠更多的患者。在需要诊断的人面前，它的优势大于劣势，那就选择即可。另外，报告解读的过程有医技科室和或第三方检测机构的把关，即便污染很头疼，但整个行业已经或者正在尽可能的去降低令人咬牙切齿的污染问题的路上。所以，扩增子tNGS的阈值是多少呢？这真的是一个庞杂的命题，这一章节除了结核分枝杆菌稍有涉及外，也没有给出明确的答复。但是，通用的逻辑是，既然其紧随mNGS行业壮大，与mNGS应用场景有一定的交叉，并且形成了更广泛的检测市场，那与mNGS的不自觉的对比，借鉴mNGS的解读逻辑是必然的。在阈值设定方面，我们初步形成一些结论，比如tNGS的阈值可能会比mNGS的更高一些，但也需要不同病原体差异化，进行更精细化的阈值设定；tNGS的阈值也会加权考虑多个位点扩增的情况；面对更为难搞的样本交叉污染难题，tNGS的阈值灰区样本要配套对应PCR验证体系或者有必要时重新取样。路还很长，期待有一天，我可以明确的写下来，tNGS的阈值是多少，板上钉钉，不必忐忑，不必纠结。
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