微流控PCR芯片在核酸检测中的现状及未来展望

2025-1-24 14:58| 编辑: 归去来兮| 查看: 1588| 评论: 0|来源: IVD分享库

摘要: 聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA分子的特定片段

聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA分子的特定片段，广泛应用于病原体和基因突变检测、食品安全和临床诊断等领域，但存在仪器体积大、散热高等缺点。研究表明，微流控技术与PCR反应相结合，具有集成化、自动化、微型化和可移植性的特点。与此同时，微芯片的各种设计制造有助于不同的应用。本文综述了多种微流控芯片搭载多种PCR技术(PCR、RT-PCR、mPCR、dPCR)以及荧光、电化学、电泳等检测方法的主要工作。讨论了基于PCR的微流控芯片在病原体及基因突变检测、疾病预防与诊断、DNA杂交及小体积样品处理等方面的发展与应用。

微流控PCR芯片概览

1、传统PCR技术比较

2、结合qPCR的微流控芯片

3、结合mPCR的微流控芯片

4、结合dPCR的微流控芯片

基于微流控芯片的mcdPCR系统通常是集成系统。mcdPCR主要是利用微机械加工将带有微通道和微腔的芯片加工成充满PCR反应液的独立微反应腔阵列。样品的引入和隔离可以通过集成的微型泵和微型阀来控制。Xu等人提出了另一种基于 PDMS 的自吸微流控芯片，带有缓冲室，便于操作 dPCR。芯片的唯一入口可以达到负压分离样品的目的。准确检测 10 倍连续稀释 DNA 模板的能力对于 dPCR 的广泛应用具有重要意义。除了通过微阀结构分离微反应室中的溶液外，还有其他方法可以形成独立的微单元。Zhang等人使用数字微流体技术和介电润湿效应在集成芯片上完成样品转移、混合和 DNA 扩增的步骤。Song等人将PDMS芯片抽真空产生负压，利用材料的气体溶解性使样品自吸，使采样过程不需要微阀结构，然后分配到反应室，可实现三个样品同时放大。Wang等人。开发了一种填充高孔琼脂糖微珠的微图案超多孔吸附阵列芯片（μSAAc），利用微凝聚珠的吸水能力和自发填充PDMS微孔构建多孔微凝胶，无需复杂操作和微阀装置即可自发分离流体。利用微凝聚珠的吸水能力，无需复杂的操作和微阀装置，即可自发分离流体。这种低成本、易于制造、无需设备的液体分析技术促进了基于微流控芯片的dPCR技术在基础研究和临床领域的应用。

ddPCR技术将PCR反应液分成大量的纳升至皮升，同时在这些小液滴中进行PCR扩增，分析扩增后液滴的荧光信号，计算出目的基因的拷贝数。以液滴为反应单元的PCR系统系统结构更简单，成本更低，结果更准确。Chen等人使用水相通过微通道阵列分散成稳定的油包水乳液液滴，并进行高动态范围的dPCR反应。事实证明，这种经济有效的方法不仅节省了复杂的微流控设备和控制系统，而且大大抑制了材料损失和交叉污染。此外，Wang等人使用压缩空气驱动流体产生液滴，无需外部微阀即可实现实时监测。该系统只需要一个恒温加热器即可实现dPCR所需的稳定热循环，实现每个热循环中液滴荧光的实时检测，简化了传统的dPCR过程。

在现有的一些ddPCR系统中，液滴发生器产生液滴后，需要将液滴转移到其他模块进行扩增和检测，可能会导至转移过程中液滴丢失，结果不准确。在转移过程中存在交叉污染的风险。如张等人采用喷墨打印技术，在油相中产生单分散液滴，然后稳定分散到毛细管中，简化了乳化过程，大大减少了试剂的损失，且生成的液滴在不同温度下是连续的。该方法应用于携带目标DNA的阳性液滴，并利用该系统对三个数量级不同数量的DNA进行定量评估。Wei等人开发了一种新型 dPCR 芯片，它将液滴产生、液滴阵列自组装、PCR 扩增和荧光检测集成到一个设备中。它的特点是制造成本极低、定量能力强且有小型化的潜力，满足DNA分子定量标准。

随着微流控技术的成熟，基于微流控技术的dPCR技术发展迅速。两者结合可以避免繁琐的样品分散操作，在短时间内自动形成一大型的独立反应单元，通量高，提高了准确度和灵敏度。与传统的qPCR技术相比，dPCR技术具有极高的灵敏度、精密度和特异性，特别适用于细微的拷贝数变异、稀有基因突变和核酸绝对定量。广泛应用于医疗、微生物检测、食品安全等领域。

微流控PCR芯片的结构类型

不同样式的微流控PCR芯片的示意图。红色表示变性，蓝色表示退火，黄色表示延伸

微流控PCR芯片结构类型总结

1、Micro-chamber PCR chips

2、Serpentine microchannel PCR chips

3、Spiral microchannel PCR chips

4、Oscillating-flow PCR chips

5、 Closed-loop PCR chips

6、Straight channel PCR chips

7、Others PCR chips

一些研究人员将上面介绍的几种结构组合在一起。Madadelahi等设计了一种集蛇形通道和螺旋通道于一体的高通量两相PCR装置。

微流控PCR芯片的应用

随着微流控技术的快速发展，微流控PCR芯片正朝着结果简单、功能集成、便携和一次性的方向发展。微流控PCR芯片现在被用于识别病原体、核酸病毒和基因突变，以及预测和诊断疾病和检测低浓度样品。COVID-19正在席卷全球，尤其是现在。我们的共同目标是创造既便携又集成的核酸检测技术。微流控PCR芯片技术的进步，赋予了生物、医学等领域巨大的应用价值。

1、与病原体检测相关的微流控PCR芯片

2、与核酸病毒检测相关的微流控PCR芯片

3、基因突变检测相关的微流控PCR芯片

4、与疾病预防和诊断相关的微流控PCR芯片

5、与DNA甲基化检测相关的微流控PCR芯片

6、与低丰度样品检测相关的微流控PCR芯片

结论和未来展望

尽管典型的PCR反应过程简单明了，化学扩增效果明显，但对硬件条件的依赖仍然是PCR广泛使用的一个重要障碍。提高热循环率、最小化设备和使用更少的化学品需要进一步开发。传统的台式热循环仪仪器体积大，试剂消耗大，导至系统热容量增加，进而降低了温度转变速率和反应速率。这些缺陷可以通过PCR设备的小型化来解决。近几十年来，微流控PCR设备的发展有了很大的进步，改变了传统的核酸扩增PCR方法体积大、成本高、耗散大、易污染和降解等问题。热传导速度加快，提高了热循环的效率。

微流控PCR芯片已经从单个反应细胞发展到微阵列，从简单的蛇形通道、螺旋形通道、振荡、闭环、直通道，到多个组合的复杂通道。具体而言，优点如下：

i)降低生产成本和使用成本。ii) 减少 DNA 扩增时间。iii) 最大限度地减少用于 PCR 研究的生物材料的数量。iv) 减少二聚体和非特异性 PCR 产物的数量。v) 增加 PCR 设备的集成度和便携性 vi) 避免同一管中试剂之间的交叉影响。这些极大地解决了传统PCR反应中遇到的问题。

微流控PCR已与多种检测方法相结合。其中，荧光检测是最灵敏、最方便的检测方法。开发低成本、高通量、高速的检测方法是未来研究的重点。系统集成和自动化可以减少手工操作、减少交叉污染及试剂和样本消耗。在COVID-19的趋势下，集自动化和小型化于一体的检测平台是未来的发展方向。

本综述讨论了PCR技术（PCR、RT-PCR、dPCR、mPCR）与微流控芯片上各种通道结构的结合，并介绍了相关的检测方法。还总结了一些已报道的生物分子分析应用，由于芯片加工制造平台还不够普及，微流控PCR技术设备仍需要更好的改进。核酸提取、扩增和检测的一体化将是未来研究的重要方向。

本研究得到国家自然科学基金面上项目（81973569, 21727814, 21621003, 82130113）、四川省科技厅重大专项（2019YFSY0046）、四川省科技厅区域创新合作项（2020YFQ0032）等资助。

来源：Trends in Analytical Chemistry（TrAC Trends in Analytical Chemistry）

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.trac.2022.116737

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