田埂：从解读生命密码，到解决百姓健康需求

从解读生命密码，到解决百姓健康需求

——DNA 测序技术加速临床普及

   近来随着华大基因和达安基因测序仪和高通量测序技术的临床应用均通过临床审批流程，高通量测序技术在中国已经有两套测序系统获得CFDA的认证。DNA测序行业已经从星星之火，开启了燎原之势。曾经一度被人们誉为前沿高端的科研项目，已经开始进入平常百姓的健康生活。DNA测序行业为何会迅速呈现出如此大的市场认可度，测序技术对我们的医疗健康，未来生活会带来怎样的影响？本文笔者作为经历过三代测序技术变革的业内人士，将从专业角度进行解读。

作者田埂系清华大学医学院，基因组测序平台负责人；测序中国专家顾问团成员

三代测序技术变革

    一、什么是DNA测序

    要了解DNA测序技术，首先需要明确基因的概念，维京百科里有这样的描述：‘A gene is the molecular unit of heredity of a living organism’, 意思是“基因是生命遗传的分子单元”，1928年英国科学家Frederick Griffith通过转化实验导至了遗传物质的发现，DNA被确定为主要的遗传物质。DNA双螺旋结构的发现，人们开始了解到DNA的结构。DNA虽然是由简单的A、T、C、G四种碱基组成的，而这四种碱基的排列顺序却可以“千变万化”，而基因的奥秘就蕴含在DNA排列的顺序里。DNA测序就是把DNA的排列顺序排列出来， 正是如此，解码生命的关键一步，就是DNA测序

    二、“人类基因组计划”的重大需求，加速一代测序仪产业化

DNA测序技术开始真正意义的大规模使用，得益于因发明测序技术而获得自己第二个诺贝尔奖的Frederick Sanger和其团队的工作，能够在测序技术领域获得诺贝尔奖，足见DNA测序技术的重要性。Sanger先生1980年获得诺贝尔奖的“双末端终止法”也就是现在我们俗称的“Sanger测序法”被美国PE Biosystems（ABI）公司自动化后，大大加速了测序技术的大规模推广，从而使得被誉为二十世纪三大科学创举之一的“人类基因组计划”得以实施。

“人类基因组计划”（HGP）由美国能源部1984年提出，旨在通过DNA测序技术测序人类的所有基因。但在当时的技术条件下，测序人的基因组是十分艰巨的工作，因为每台测序仪每次只能测序人类基因组的百万分之一，完成HGP需要几百台测序仪同时工作数年，因此，这需要非常专业的团队支撑。1988年，美国成立“国家人类基因组研究中心（NHGRI）”由因发现DNA双螺旋结构而诺贝尔奖的James Watson出任该中心第一任主任。“人类基因组计划”后来成为多国合作项目，也使得全球几大测序中心得以应运而生，其中包括：美国贝勒医学院基因组研究所、华盛顿大学基因组中心、英国桑格研究所、中国华大基因研究中心等，当时这几大中心均同时使用多台测序仪共同“奋战”，场面堪称“壮观”。

“人类基因组计划”最终由六国科学家用了10年时间并花费30亿美金而完成，其中中国参与了1%，被业内人士称为“1%项目”，因其在人类基因研究方面的突出贡献被刻在了“中华世纪坛”的青铜甬道上。中国的华大基因也因此一举成名，在国际上名声鹊起。

这其间也有“搅局者”“科学狂人温特”（Craig Venter）利用全新的“散弹法”策略向“人类基因组计划”组织宣战，宣称自己能更快的完成人类基因组测序。当然，温特的“搅局”也在客观上加速了人类基因组计划的完成。

   “人类基因组计划”完成以后，很多科学家认为“基因组时代”已经过去，从而将研究的重点转移到了“后基因组”时代的“功能基因组”研究上，由此催生了一系列研究基因转录的研究方法，例如生物芯片技术等。

    三、“后基因组”时代的研究加大了对高通量测序技术的需求

   在已经有比较完整的人类基因组参考图谱以后，研究者们启动了HapMap计划，来研究人类基因组的个体差异。而通过HapMap计划，科学家们最终发现，人类的遗传变异程度，远远大于预期，一个参考的基因组远远不够，由此，对高通量测序技术的需求更加明确。454公司通过“大规模平行焦磷酸”测序法，以高于Sanger法测序仪数倍的通量和速度，测序了James Watson的基因组，并将其公布。但是即便其成本已经降低数倍，却依然非常昂贵，花费巨大。而对人类疾病等研究领域，却需要大量患有同样病症的病人的基因组与对照组同时进行测序研究，因此对测序技术的要求就更加巨大。

美国国家基因组研究院（NHGRI）最早提出了“千元基因组”挑战，对第一个实现千元基因组的个人（公司）提供百万美元奖励。

    四、技术突破引发测序技术迅猛发展

    2005年，被罗氏收购的454公司首先推出了二代测序仪（从通量上来讲，应该被定义为一代和二代过渡产品），启动了测序仪通量加速的快车。2006年，与Lynx公司合并的Solexa公司，推出了基于“可逆转的终止法”的大规模平行测序仪Genome Analyzer(GA)，第一次实现了每个测序反应1G的通量，在AGBT会议上一经宣布便引起轰动，它打开了人们“快速”测序人类基因组的想象，Solexa公司也因此于2007年初被Illumina[]选中并迅速收购，可以说Illumina收购Solexa才真正让二代测序仪进入高速研发快车道。

经过重新设计的GA脱胎换骨，特别是Hiseq系列测序仪的研发完成，成为名副其实的“怪兽”测序仪，由此打破了著名的“摩尔定律”。在这里不得不再次提到中国华大基因在这一过程中所作出的贡献，从亚洲第一台装机的GA测序仪（第一个采购的是日本），炎黄一号基因组在美国《Nature》(《自然》)杂志发表，到后来掷亿元采够128台Illumina Hiseq测序仪成就世界最大的“测序工厂”，可以说这股来自中国的力量，在Illumina统治测序仪市场道路的关键时期，起到了绝对的关键性作用，双方也因此在这一时期形成了互惠互利的战略合作关系。华大基因的工作不仅提高了人们对高通量测序技术的认识，推广了高通量测序技术的科研和临床应用，同时取得了举世瞩目的科研成果，让人们真正了解基因组是可以集产、学、研为一体的科学技术产业方向。

Illumina统治测序仪市场的道路，事实上并非一帆风顺，测序仪的核心技术始终掌握在美国人手里，而在测序技术的研发上，美国二代测序“教父”级人物哈弗大学教授George Church的实验室于2006年公布了Polonater测序仪组装的详细流程，并表示欢迎研究者继续开发，吸引了众多跟随者们蜂拥而至。那个时期的Polonater测序通量也突破了1G，从技术参数上看其与Illumina的GA不相上下，公开的平台为大家提供了与Illumina 测序仪一较高下的机会。ABI公司（前身是PE公司）是其中的代表，ABI公司在Sanger测序仪时代几乎垄断了整个测序仪市场，在二代测序仪兴起之初，即2007年，ABI公司推出了SOLiD测序平台，SOLiD平台一度在通量上领先Illumina的测序系统，但是由于采用复杂的“乳液微珠PCR”测序产量很难控制，“双碱基解码”造成与其它测序技术的分析软件系统难兼容，以及实验操作过程过渡繁琐等原因，SOLiD经过几年挣扎最终在跟Hiseq的较量中败下阵来。

2008年ABI（已经被Invitrogen收购，组建了Life Technologies公司）同时还收购了号称第三代测序技术的VisiGen，而后者在被收购后便销声匿迹。2010年ABI(Life Technologies)又收购了Jonathan Rothberg创建的Ion Torrent公司，Jonathan Rothberg同样是454测序仪的发明者，Ion Torrent公司的PGM是一个利用半导体检测技术的测序系统，Life Technologies公司用低价策略迅速占领入门级测序技术市场，并由此取得了一定市场占有率。但是在测序通量上，PGM以及后来的在其基础上发展出来的Proton测序仪虽然均难以对Illumina公司的Hiseq测序仪造成实质威胁，但在测序速度上却占有一定优势，也因此在临床应用上有一定的发展空间。

   需要同样被提到的是Complete Genomics（CG）公司，其所采用的纳米球扩增技术独特，测序通量曾一度拥有超过Illumina 的测序技术，但由于专利问题的限制，一直没有出售商业化的测序仪，只是通过提供人类基因组重测序服务生存，但却在美国市场对Illumina 测序平台的“人重测序服务”造成很大威胁。

2012年Complete Genomics（CG）公司被华大基因收购。华大基因继续研发，并生产了BGI-1000测序仪。华大对CG公司的收购，导至其结束了与Illumina 公司的“蜜月”期。

    2014年初，Illumina 在新品发布会上 推出了Hiseq X10平台，实现了“千元基因组”的目标，完成了“千元基因组”挑战。Hiseq X10真正让“个人基因组”成为普通大众可能负担的“健康服务”，也大大加快了人类基因组数据库的积累速度。

    前文提到的三代测序仪，笔者需要提到几家公司，Helicos是第一家商业化单分子测序技术的公司，但是由于仪器过渡“娇贵”，数据质量又比较差，公司于2010年宣布停止运营。而真正实现批量销售的是Pacific Biosciences的PacBio RS测序仪。

   三代测序仪在宣传上有诸多优势，——模板无需像二代测序进行扩增即可测序、长读长、实时、单分子等，而且Oxford NanoporeMinION测序仪做到了只有USB存储器大小，罗氏公司又在2014年收购了另外一家三（四）代测序仪公司Genia。但是三代测序基于单分子酶学或者单分子电学，信号容易丢失，通量不高，单碱基的测序成本也居高不下，难以对Illumina的“怪兽”测序仪形成实质竞争，目前并未真正实现普及。

高通量测序技术的临床应用

    Sanger测序仪中，PE公司（ABI公司）的377、310、3100、3130测序仪被FBI批准用于“司法鉴定”，也就是“亲子鉴定”、“罪犯DNA数据库”的个体身份鉴定。而在人类基因组计划实际协调人NIH主任Francis Collins的推动下，2013年9月，Illumina 公司的MiseqDx平台，首次通过了美国FDA的技术认证，作为开放平台和囊纤维化的试剂产品准许进入临床应用。

Illumina 用一个入门级的测序仪叩开了从纯科学研究的平台进入临床诊断领域的大门。而在中国，华大基因携CG技术的BGI-1000测序仪也首先取得了CFDA的注册证，进入临床应用。并且与Life Technologies合作，推出了BGI-100测序仪。达安基因也通过与Life Technologies合作获得了CFDA注册证。随着测序仪作为通用仪器得到CFDA证书，测序技术的临床应用也真正驶入了高速通道。

    一、检测个人基因组

    个人基因组，即个人的所有基因的总和。科幻电影里常出现这样的剧情：

   “人一出生就了解自己的一切遗传信息，生老病死都一一掌握。可以通过这些遗传信息‘筛选’性状最好的后代，甚至定制后代的事情都依赖于对个人基因组信息的完整了解。”而高通量测序技术，正带给我们电影桥段变为现实的无限可能性。高通量测序技术将测序人的基因组的成本降低到千美元的水平，也就是对很多家庭来讲，已经负担的起基因组测序的成本。对个体性状的认知、个体化用药、遗传、疾病的防治等都有重大的意义。

肌肉的爆发力和耐力是一对矛盾的性状，ACTN3基因的一对等位基因中的一个基因型可编码α肌动蛋白，有助于快肌纤维运作，从而提高运动的爆发力，而另外一个等位基因型，则代表肌肉的耐力，这就是所谓的运动员“基因”，人们通过基因检测，了解到这些个体特征以后，再决定选择什么样的运动项目发展，这对正在选择项目的运动员就具有很强的参考价值。

还有很多表型与遗传疾病都已经被研究者存储在人类遗传变异数据库里面，相关的疾病超过7000种，很多疾病虽然并没有出现很严重的表型，但是可能影响到我们的生活质量，例如对乳糖耐受、酒精代谢等相关基因的基因型了解，将帮助人们更好的安排生活，提高健康水平。

    二、游离DNA检测（无创检测）

1997年香港中文大学卢煜明教授（当时还在牛津大学）通过实验检测到怀有男性胎儿的孕妇外周血残留的胎儿游离Y染色体DNA，从而打开了人们通过游离DNA进行无创产前诊断的大门。传统的产前诊断使用的是羊水穿刺或者绒毛穿刺的方法，这些方法虽然是产前诊断的金标准，但是由于需要手术，是有创的方法，有造成孕妇的流产、胎儿畸形、感染等风险，而且手术操作较为复杂，再优秀的医生一天也只能操作少量手术，还存在羊水细胞培养不成功需要重复手术的风险，因此通过母体游离DNA检测胎儿的遗传和发育疾病，就成为医疗工作者和孕妈妈的共同梦想。

    但是，实时荧光定量PCR、数字PCR、芯片（Array CGH）、质谱等多种技术方案，均因为通量、准确度、灵敏度和假阳性率、假阴性率的问题存在无法令人满意的问题。随着测序技术的发展，2008年卢煜明和斯坦福的Stephen Quake先后发表文章描述了通过母体外周血中的游离DNA进行测序，可以准确判断胎儿的染色体非整倍性的技术。文章在业界产生重大影响，特别是在中国国内，由于一胎制的政策，以及传宗接代的传统价值观影响，高昂的医疗成本和稀缺的临床资源（在北上广等城市很多需要羊水穿刺的孕妇因为无法预约到床位而放弃手术）国人对无创产前技术的需求远远大于其它国家。由此促使国内华大基因和贝瑞和康等公司（机构）纷纷投身产前诊断事业，并以此拉开了高通量测序在国内临床应用的大幕。

值得一提的是华大基因开始研发无创产前诊断技术研发的时间可以追溯到2006年，并曾与卢煜明教授合作开发高通量测序无创产前诊断技术，但由于初期的专注度欠缺，专利保护法律意识的缺失，从而造成起步早，但真正核心专利却布局较少的局面，虽然国内目前从事无创产前的公司均与华大基因颇有渊源，甚至有些公司完全移植华大技术，但是华大却无法通过专利保护等法律手段维护其权益。  

值得庆幸的是，通过延伸上游测序技术，树立门槛，华大基因打通了上下游的产业链条，在这里笔者也由衷祝福华大好运，真正扛起国人基因组临床应用的领军大旗。

从理论上讲，游离DNA拥有整套的胎儿基因组，按照孕周和个体差异，胎儿游离DNA在母体的游离DNA比重从1%到8%不等，并且随孕周有所变化，只要保证足够的测序深度，和将测序错误率控制在一定范围内的情况下，完全可以对胎儿的基因组有足够的覆盖，这样就可以检测胎儿除染色体易位、倒位的其他染色体疾病和单位点（单基因）的所有遗传疾病。因此无创产前诊断技术在临床应用的前景十分广阔，从而成为临床医疗产业界竞争的重点。

    三、肿瘤的突变检测和个体化用药

虽然已经可以直接通过测序全基因组拿到整个基因组的信息，但是目前临床上应用较多的却是基于DNA捕获和多重PCR的目标区域测序技术，原因是，冗繁的数据对临床并没有实际意义，诊断和用药只需要对临床应用具有参考价值的信息部分。对诊断相关的基因，或者药物的靶点基因进行测序，就可以进行诊断和用药。

肿瘤之所以复杂，在于肿瘤本身的“异质性”。可以理解为，我们看到的肿瘤细胞，实际上每个细胞可能都是不同的，如果我们针对其中某一个细胞进行治疗，即便治疗方案有效，杀死了这个细胞，也无法达到最终治愈的目的，因为还有别的有害突变存在。因此，我们需要评估“有害突变”的频率（在整个细胞群里的含量），再有针对性的进行治疗或者选择治疗的方案，当然这均以进行基因测序为前提。

在美国Foundation Medicine公司已经成功商业化200多个基因，3800个外显子的肿瘤检测试剂盒，并进行了临床实验。Illumina 和Life technologies也分别推出了自己的肿瘤诊断试剂盒。在中国，也有几家公司开始提供肿瘤个体化检测和用药的服务。

    四、病原微生物的鉴定

二代测序用于病原微生物检测，众所周知的是德国“毒黄瓜”事件，2011年5月，德国爆发疫情，迅速造成近千人感染，死亡数十人，而后华大基因和德国汉堡大学医学院合作，利用高通量测序技术在3天内完成了细菌的基因测序和分析，迅速找到元凶的溶血和致病机理，该文章在《新英格兰医学》杂志发表。

去年的H7N9肆虐时，江苏省疾病预防控制中心通过高通量测序技术对H7N9流感病毒进行溯源分析，发现新型H7N9流感病毒是从二级批发市场传播到零售市场，进而传染给人类，这也解释了大部分H7N9感染患者有过禽类接触史的流行病学调查资料，研究成果同样发表在《新英格兰医学》上。

通过高通量测序快速鉴定未知病原微生物，或者对病原微生物进行分型，合理选择抗生素等均是高通量测序的应用方向。

五、遗传病检测

如笔者在前文所述，已经报道的遗传病有7000多种，通过对致病基因进行高通量测序，也同样能够确诊疾病。目前已经有公司将主要的100种到500种遗传病作为诊断项目，特别是结合无创产前诊断，对已经有一个遗传缺陷后代的父母进行生殖选择，将是很实用的技术。

    六、肠道微生物

    肠道微生物研究，是近年的研究热点，2009年，Jeffrey Gordon发表了著名的“双胞胎”胖人和瘦人的肠道微生物差异研究，证明遗传背景几乎一样的双胞胎，由于肠道微生物的不同可能导至体重上极大的差异。并随后证明了通过移植肠道微生物可以导至瘦鼠变胖；2011年来自EMBL的Peer Bork教授首先提出“肠型”的概念，将人体肠道分为拟杆菌（Bacteroides）；普氏菌（Prevotella）和瘤胃球菌（Ruminococus）三种不同的类型，并证明肠型的分布与性别、年龄、体重指数和国籍没有关系。2012年，华大基因发表文章，揭示了糖尿病患者独特的微生物特征；而后肠道微生物与肠炎、肠癌、神经发育等的关系，逐步被报道出来，使人们了解到肠道微生物与我们的密切关系。肠道微生物的检测和调整，将在未来成为一个重要的产业化方向。而高通量测序技术无需培养就可以通过“随机”的测序得到微生物的基因片段，通过这些基因的分析，研究者们就可以分析出肠道里存在哪些有益或者有害的微生物，这些微生物是否平衡。在这一领域，高通量测序技术同样是不可替代的工具。

测序技术是通往数字化生命的关键技术，而高通量测序技术是目前最有可能帮助人类探究数字化生命的测序技术。相信，随着技术的不断进步和科学家们的不懈努力，测序技术必将进入我们生活的方方面面，为我们的健康生活提供帮助并创造福祉，为我们对生命本身的探寻开启光明之路。