免疫类诊断试剂方法学比对相关性优化总结

      免疫类诊断试剂方法学比对相关性优化是一个系统的过程，旨在通过与参比方法进行方法学比对，通过相关性比较来确定所开发产品与主流方法间的一致性水平。以下是一个总结，概述了优化免疫类诊断试剂方法学比对相关性的关键方向：

一、选择合适的参比方法与样品：1）选择合适的参比方法：选择一个已经被广泛认可和验证的参比方法，这个方法应该是行业内被普遍接受的方法。参比方法的原理应与待开发的产品相似，以确保比对的可比性。参比方法应具有较高的准确度、精密度和重复性，以确保其作为比对的可靠基础。2）选择合适的样品：样品应涵盖目标检测物的全浓度范围，包括低、中、高浓度，以全面反映开发试剂的检测性能。样品应包括正常、临界值和病理水平的样本，以确保试剂在不同情况下的性能都能得到评估。3）标准化样本处理：样本处理应遵循标准化操作程序，以确保样本稳定性，减少因处理差异导至的比对误差。应排除一些常规可能的干扰因素，如脂血、黄疸和溶血等情况，或通过特殊处理来模拟这些干扰因素，以评估试剂的稳健性。样本的采集、储存、运输和处理应严格按照规定的流程进行，以确保样本的质量和一致性。

二、抗原抗体主要原材料的选择：通常来说对相关性影响最大的因素就是选用的抗原抗体类主要原材料，这里以抗体为例进行说明，之前我们在公众号里已经就抗体的选择进行专门的讲解，这里我将与相关性优化有关的一些抗体筛选方法进行总结：1）抗体类型的匹配：通过产品说明书了解比对产品中使用的抗体类型，比如使用的是多抗还是单抗、全抗体还是抗体片段、单抗是一对单抗还是更多。尽量使自己开发的产品的原料类型与比对产品一致，以增加相关性。2）选择与参比方法一致的抗体的位点：选择与参比方法一致的抗体的位点。相同或相似的抗体位点可以增加检测结果的统一性。通过发表的文献、专利或产品说明书等文档，了解参比方法的抗体位点信息。与原料生产商或经销商沟通，获取比对产品的原料信息。进行抗体位点或抗体氨基酸序列的分析，以了解不同原料间的相似性。3）高亲和力及高特异性抗体的选择：对于夹心法产品，选择高亲和力和高特异性的抗体对，以提高检测的准确性和特异性。进行交叉反应物的评估，以评价不同抗体间的相似性和特异性。

三、免疫检测原理的选择：方法学原理的一致性，选择与参比方法相同的方法学原理。例如，如果参比方法是基于间接法，那么自研项目也应采用间接法。避免在参比方法和自研项目之间使用不同的检测原理，如夹心法与间接法、竞争法与夹心法等，因为这些不同的原理可能导至结果的显著差异。这几年来在国内的小分子检测领域有使用双抗体夹心法检测小分子项目的报道及应用，且与主流的竞争法或者质谱方法有不错的相关性水平。这里要说一下，小分子本身作为半抗原，其至多被一个抗体识别，不管是竞争法还是夹心法的抗体针对的位点都相同。这类项目之所以能被双抗体检测，需要利用配对抗体中有抗免疫复合物抗体，即识别另一株小分子特异性抗体与小分子反应后的结构变化，与传统的夹心法原理不同。关于小分子的夹心法检测我也仅是通过相关文献或资料进行了解，并未实际使用过，希望有使用经验的读者可以留言或者加微信交流。

四、试剂配方及反应条件的优化：在配方的优化中，针对相关性的优化主要是保证一定的离子强度、合适的pH、使用有效的阻断剂等。反应条件的优化可以模仿参比试剂的反应条件，与参比试剂的反应条件相似更容易有好的相关性。在灵敏度有保证的情况，使用更低的样品加样量，更大的试剂体积，可以有效降低样品的基质效应，使检测结果更准确。

五、方法学比对的实验设计：1）合理的样本数量及分布：样本数量应不少于40例，均匀分布于检测范围中，要保证检测的样本中没有HOOK的样品及各种干扰样品。2）校准品的准确性：进行方法学比对检测时，如果计算的是皮尔逊相关系数（r），需要保证校准品准确无误。如果计算肯德尔相关系数（τ）和斯皮尔曼相关系数（ρ），则不受校准品准确性的影响。3）选择合理的线性回归模型：通常选择有最小二乘法（ORL）回归分析、加权最小二乘法（WLS）回归分析、Passing-Bablok回归分析和Deming回归分析。上述4种模型的选择与方法学的正确度有关，与相关性无关。4）比对实验标准化、自动化：比对实验尽可能的标准化，自动化，降低操作产生的比对误差。5）数据收集和分析：对比对数据要进行离群分析，剔除离群值，并对离群样本进行有效的评估分析。

六、包被及标记偶联工艺的优化：1）偶联基团优化：共价偶联时，对偶联基团进行优化，保证抗体的可变区不参与偶联反应。2）包被方法优化：可以使用定向偶联包被技术，实现抗体的定向包被，最大程度保证抗体活性。3）有效的封闭：封闭可以降低非特异性反应，提高低值样品的相关性水平。4）亲和素-生物素系统应用：可以在包被时使用亲和素包被，抗体标记生物素，反应时抗体和检测物先反应温育后再加入亲和素包被微球。使免疫反应过程更多的处于均相反应的状态，有利于提高精密度、灵敏度及相关性。

      以上是我总结的关于相关性的优化方向，希望对你有用。