背 景 mRNA疫苗是将编码抗原的mRNA递送到人体细胞内，在细胞内翻译后产生相应的抗原蛋白，从而诱导机体产生有效的免疫反应。mRNA稳定性、翻译效率以及内在免疫原性是mRNA成药的关键。mRNA的5’帽子结构可以防止mRNA因外切酶降解，募集翻译起始因子(eIF4E)促进核糖体识别和翻译起始，防止mRNA被固有免疫受体识别。因此，优化mRNA帽结构（加帽）对于提高mRNA疫苗的生物活性和降低免疫原性是至关重要的。 目前，共转录加帽(“一步法”加帽)是体外制备mRNA加帽的首选方法。但是，制备工艺复杂且结构受专利保护的帽类似物原料，成为了国内外mRNA上游供应链的“瓶颈”。无专利壁垒、加帽效果好且性价比高的新型帽类似物是mRNA疫苗/药物生产企业的首选，却也是mRNA原料企业亟需攻克的难题！ 申基生物，作为拥有核心技术的mRNA疫苗上游原料供应商，为了实现mRNA行业自上而下的全产业链替代，其强大的研发团队一直深耕于开发和优化新帽类似物结构，进行自主知识产权帽类似物原料产品研发，为全球mRNA研究者排忧解难！目前，申基生物已获得7项帽类似物结构专利，除了已经获批的帽类似物专利，申基还有10余项申报中的其他新型帽类似物专利。此前，申基生物已分享过自研帽类似物产品部分数据，本篇推文将特别展示申基自主知识产权新型帽类似物Cap5 (ENE) 的研究成果，旨在为心系新型帽类似物产品实验效果的mRNA行业人交出一份答卷！ 01 项目背景 带状疱疹(HZ)，是由潜伏的水痘-带状疱病毒(VZV)再激活引起的，这种病毒通常在儿童时期引起水痘，水痘痊愈后，病毒依然会长期潜伏在体内。随着年龄增长，免疫功能逐渐下降，病毒会再激活并引发带状疱疹。与水痘不同的是，带状疱疹并非“一次中招，终身免疫”，且90%以上的成人体内都潜伏有水痘-带状疱疹病毒。截至目前，全球共有4款带状疱疹疫苗获批上市，主要技术平台为减毒活疫苗和重组蛋白疫苗。减毒疫苗对老年患者效果不佳，且不能用于免疫缺陷人群；亚单位疫苗虽对老年患者效果好，但副作用较大。mRNA作为新一代疫苗技术，凭借其快速的研发优势和平台化的生产工艺，有望成为新一代疱疹病毒疫苗的新选择。 02 实验方法 申基与VZV疫苗项目的合作者一起设计开发mRNA疫苗。抗原选择—序列设计—体外转录—mRNA-LNP制备—动物实验，经过一步步实验验证，设计的VZV_mRNA1和VZV_mRNA2带状疱疹mRNA疫苗在小鼠身上表现出了非常强的免疫效果。另外，在合成VZV_mRNA1和VZV_mRNA2时，特使用了申基自主知识产权的新帽类似物Cap5(ENE)和传统的m7GpppAmG，以评估Cap5(ENE)的实验效果。 03 实验结果 3.1 mRNA/LNP均达到交付标准 申基生物具有mRNA/LNP制备以及检测能力，且在兽用生物制品领域如RABV、FMDV、PEDV、PRV、PRRSV、ASFV等动物mRNA创新疫苗研发与工艺研究方面提供整体解决方案，有着丰富的经验和多项成功案例。此次联合开发VZV mRNA疫苗，针对不同的序列进行mRNA/LNP制备，经检测，VZV-mRNA 疫苗均达到交付标准！ Table 1. Cap5(ENE) vs. CAP m7GpppAmG mRNA总体制备CGE纯度≥82%；加帽率≥96%
Table 2. Cap5(ENE) vs. CAP m7GpppAmG mRNA-LNP制剂 总体制备粒径90~100nm；PDI≤0.08，包封率≥95%
3.2 细胞转染—靶蛋白表达水平高 VZV_mRNA1和VZV_mRNA2 LNP制剂10μg分别转染HEK293T细胞，转染后48hr对靶蛋白gE进行特异性抗体（ab272686）WB表达验证；结果表明，Cap5(ENE) VZV mRNA疫苗gE蛋白表达水平显著高于CAP m7GpppAmG VZV mRNA疫苗，总体蛋白表达率为m7GpppAmG的2.04倍和1.72倍。
图1 HEK293T细胞转染测试靶蛋白表达水平 3.3 体液免疫—特异性抗体滴度高 VZV_mRNA1和VZV_mRNA2疫苗和对照商品苗分别在D0、D21对小鼠进行10μg肌肉注射，每次免疫后在D7和D14眼眶取血，分离血清，进行血清gE特异性IgG抗体水平检测。结果表明，Cap5(ENE) mRNA疫苗抗体效价均高于CAP m7GpppAmG，其中VZV_mRNA2（Cap5(ENE)）疫苗IgG抗体水平分别是VZV_mRNA2（CAP m7GpppAmG）的4.0倍(D7)、 1.43倍(D14)、1.46倍(D28)、 2.24倍(D35)。
图2 血清gE特异性IgG抗体水平检测 3.4 细胞免疫评价—IFNγ分泌高 VZV_mRNA1和VZV_mRNA2疫苗和对照商品苗分别在D0、D21对小鼠进行10μg肌肉注射，每次免疫后在D7和D14取脾脏，分离脾淋巴细胞，进行脾gE特异性淋巴细胞IFNγ分泌水平检测。结果表明，Cap5(ENE) mRNA疫苗分泌高于CAP m7GpppAmG，其中VZV_mRNA2（Cap5(ENE)）疫苗细胞因子IFNγ分泌水平分别是VZV_mRNA2（CAP m7GpppAmG）的1.07倍(D14)、1.06倍(D28)、 1.84倍(D35)。
图3 脾细胞gE特异性细胞因子IFNγ水平检测 结论 真实评价 林昂 中国药科大学疫苗研发中心主任 申基生物是国内少有的具有自主知识产权帽类似物的企业，他们的mRNA原料品质优良，帮助我们迅速完成早研阶段的摸索工作，新推出的CAP 5不仅能够突破专利壁垒，性能效果各方面也不逊于CleanCap！ 国内创新药物行业某知名企业 帽类似物的专利壁垒，是我们下游医药企业一直如鲠在喉的事情，很高兴申基生物很早就在做新帽子攻坚的布局，不但有效打破了专利的壁垒，而且取得了不错的体内外药效，为我们后续项目的申报提供了强有力的支撑和保障。 申基生物自主研发的新型结构的帽类似物的数量还在持续增加；这些新型帽类似物的实验数据还将继续更新；与此同时，我们收到越来越多的海内外合作伙伴给予新CAP的高度评价。未来会持续跟大家分享，请大家敬请期待。 结 语 相对于帽类似物CAP m7GpppAmG，申基生物自主知识产权帽类似物Cap5(ENE)在体外转录制备mRNA时方法一致，只需在共转录时进行帽类似物替换；另外，申基生物对帽类似物进行了一系列生物学验证以及药性药理评价，结果表明，用帽类似物Cap5(ENE)制备的mRNA不仅靶蛋白表达水平高，且在小鼠体内体液免疫水平以及细胞免疫水平均高于常用帽类似物CAP m7GpppAmG。让我们一同期待Cap5(ENE)后期实验结果，届时申基生物也会进行数据分享。另外，对于申基生物已经获批专利的新型帽类似物，申基愿与mRNA行业人共享，郑重承诺不会收取任何专利费用，请大家放心使用！
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申基生物成立于2018年，专注于为客户提供生命科学领域上游原料的整体解决方案。公司核心成员源自南京大学化学生物学博士团队，拥有极强的化学生物学技术背景，多年来致力于生命科学卡脖子原料的研发和产业化，现已具有抗体发现平台、mRNA原液制备平台、mRNA-LNP制剂工艺平台、寡核苷酸制备平台、酶定向进化平台等技术，在此驱动下，衍生细胞基因治疗原料、基因核酸药物原料以及IVD原料三大产品板块。公司已入选南京市培育独角兽企业，已获多轮数亿元融资。 |
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