超滤离心管是一种膜过滤设备，是用于分离液体中不同分子或粒子的装置。它利用特殊的超滤膜，通过应用压力将液体样品推动穿过膜，从而分离不同分子或粒子的大小，广泛用于蛋白质、DNA和生物分子的浓缩、纯化和脱盐。 一、超滤与微滤 1、微滤 微滤 (Microfiltration) 涉及利用微孔膜介质去除溶液中尺寸为 0.1 μm 至 10.0 μm 的颗粒或生物体。而超滤膜的过滤范围为0.01μm至0.1μm。 微滤膜广泛应用于生物制药行业中的预过滤和除菌过滤。 在细胞实验中，微滤最常用于样品和培养基的灭菌（0.1μm微滤膜可去除支原体）。 此外，在核酸和蛋白质分析之前，使用微滤膜可以有效地从细胞裂解物中去除完整的细胞和细胞碎片。 此步骤对于确保下游应用中结果的准确性至关重要。 通过微滤，研究人员可以获得纯化的样品，从而提高核酸和蛋白质相关研究的灵敏度和特异性。
2、超滤 超滤 (Ultrafiltration) 也是一种膜过滤，通过压力或浓度梯度等力使料液通过半透膜进行分离。 超滤膜能够截留尺寸范围为1-1000kDa（MW）的分子，并允许盐和水等小分子通过。 超滤是大分子脱盐、浓缩最方便的方法，已经在蛋白、抗体、病毒、核酸、囊泡等样品制备中建立标准操作。与沉淀法相比，超滤法更为温和，避免了可能导至生物大分子失活的相变。
三、超滤离心管 超滤离心管是一种利用离心力驱动中小体积溶液通过超滤膜，进行快速浓缩、渗滤和缓冲液置换的装置。 它由盖子、过滤装置和离心管组成。
5、超滤管的放置 超滤管在离心机中的摆放需要符合切向流过滤要求，即水流方向与膜面平行。 1）水平转子 使用水平转子时放置没有特殊要求。
2）固定角转子 使用角转子时，双面垂直膜超滤管放置方式要求滤膜侧向相对。
6、超滤管的截留分子量和膜孔径关系 超滤管是一种膜过滤设备，用于分离液体中不同分子或粒子的装置。它利用特殊的超滤膜，通过应用压力将液体样品推动穿过膜，从而分离不同分子或粒子的大小。这种分离过程基于分子截留量，也就是膜的孔径大小，决定了哪些分子可以通过膜，哪些分子被截留在膜上。
分子截留量是表示超滤膜的选择性的重要参数，通常以道尔顿（Da）为单位，分子截留率表示膜可以截留的最大分子或粒子的大小。具体来说，如果膜的分子截留率是10kD，则该膜能够截留分子量小于或等于10000的分子，而分子量大于10000的分子将被截留在膜上。 道尔顿是用来表示分子质量或原子质量的单位，一个分子的道尔顿数值大约等于其相对原子质量或相对分子质量。 截留分子量和孔径之间的关系是复杂的。通常超滤膜的截留分子量是指在一定条件下,某些分子量的物质被膜截留，被截住物质的最小分子量即为膜的截留分子量，用以表征膜的分离能力；而孔径则是反映膜的通透性的重要参数。分子量通常用单位为Dalton(Da)表示，而孔径大小通常用单位为纳米(nm)表示。 超滤膜截留的分子量10000、30000、50000 60000、100000、200000、300000、500000、1000000，对应超滤膜孔径(μm) 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.1。也就是说100kd（10万）的截留分子量对应50nm的孔径。 从数据上看,似乎存在一种对应关系，如超滤膜截留分子量为100kD（10万）时,对应的孔径为0.05μm。但这种关系并不完全准确。因为超滤膜的孔径和分子量的关联并非简单的线性关系，对于具体的过滤器或分离膜，其材料、制备方法、孔径大小分布等因素都会影响它们之间的关系。 7、超滤管的离心 超滤管如果离心转速过高，可能会导至膜甚至管子的破裂，做实验时要根据不同品牌超滤管的说明书中明确指出的最大转速和离心力，调整离心转速到超滤管的承受范围内。 离心机的转速与离心机的半径以及离心力都有关系，不同半径的离心机，相同转速出来的离心力也不一样。离心力g和rpm（转／min）转换公式：g=r×11.8×10⁻⁶×rpm²，其中g有时用相对离心力（RCF）表示。
r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心管底的长度，单位为厘米（cm）。 8、超滤管使用建议 1）超滤管不能进行高压灭菌，可使用70%乙醇或环氧乙烷灭菌。 2）超滤管一般不建议重复使用超过5次。受到样品性质的影响，先用0.1M的NaOH浸泡1-2h，然后用20%乙醇清洗，最后用超纯水或缓冲液清洗3次，即可再用。 3、如果样品是线性蛋白，需使用较低的离心速度和时间避免蛋白降解。 4、浓缩过快或者过度浓缩可能会引起蛋白沉淀。建议蛋白浓缩后最终浓度不超过20mg/ml，同时降低离心速度并改用截留分子量更大的超滤管。 建议的改进方法是：①离心力降为推荐离心力的30%-50%；②改用截留分子量大的超滤管(如原本选用10kD，此时可以选择30kD)；③取出超滤管, 用吸头反复吹吸几次后再继续浓缩。 6、过滤速率受到超滤管MWCO，样品浓度，粘度，离心力和温度的影响。如果样品中固体含量超过5%，离心时间需要增加。当在4℃下运行时，流速大约比25℃时慢1.5倍。粘性溶液(如50%甘油)的浓缩时间大概是常规溶液的5倍。 7、如果要用超滤的方法分离两种蛋白，按照经验，两个蛋白的分子量要相差一个数量级（10 倍）。 8、担心浓缩过程中目的蛋白和超滤膜之间可能存在非特异性吸附，可尝试以下操作：①确保蛋白浓度不要过低；②尽量选用纤维素的低吸附超滤；③选用小体积超滤管，通过减小膜面积来降低非特异性吸附；④使用前可以先对膜进行封闭：1%脱脂奶粉，1%BSA，5%Tween 20，5%SDS，5%TritonX-100，5%PEG3000（不影响蛋白活性，不影响蛋白后续使用的前提下）。 9、对于有些样品含量非常少的情况，可尝试一下操作：①尽量选择较小的截留分子量的超滤管；②选择带有尖角收集器的超滤管以便最大限度回收样品；③使用水平转子优于角转子；④浓缩完用缓冲液清洗多次回收, 注意移液器的枪头不要碰到膜，以免膜破裂；⑤使用前可以先对膜进行封闭。 |
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