DNA甲基化检测体外诊断试剂（结直肠癌）！试剂盒研发、临床注册关键要点 ...

DNA甲基化检测在肿瘤诊断、监测、治疗效果和预后判断等方面比检测肿瘤特异突变更为广泛。所以，ctDNA甲基化检测被认为是最有价值的癌症诊断和风险评估方法之一。甲基化检测可在癌症的更早期发现癌前病变，从而为癌症的治疗提供更多的治疗方案。如何进行有效的申报注册，从而快速进入市场，满足临床的需求。

比如我国结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）的发病率和死亡率均保持上升趋势，多数患者在确诊时已属于中晚期，结直肠癌早期诊断能够有效的提升患者的生存率。结直肠镜检查结合病理活检作为结直肠癌确诊的金标准，由于其有创检测的特性而存在一定的局限性，临床患者依从性较低。通过检测粪便或外周血样本中相关基因甲基化水平辅助诊断结直肠癌具有一定的临床使用价值，是对传统诊断方法的有效补充。基因甲基化检测试剂盒是指基于核酸聚合酶链式反应（PCR法）或其他分子生物学方法，用于体外定性检测人粪便或外周血血清/血浆样本中的人基因甲基化的体外诊断试剂，临床用于结直肠癌的辅助诊断。适用人群仅限于临床医生建议进行结肠镜检查，但因病人依从性差或其他医学原因不适合接受结肠镜检查的患者。

按照产品的研发注册流程，第一步，先在企业内部完成对应的产品研发，第二步，进行临床试验确认产品的性能，并形成临床报告；第三步，将产品研发资料和临床资料合并整理，并向监管部门申报注册；产品所有的资料符合审评、审批的相关法规后，发对应的产品注册证；第四步就是向所在地的市级监管部门进行生产许可申请，获得批准后，即可上市销售。下面将按照对应四个步骤进行对应的阐述，各步骤的要求。

一、产品研发

1、产品研发是所有的事项的前提，但是产品研发的第一步是什么？确定市场需求。估计很多企业都是“拍脑袋”决定的，这也无可厚非，一般企业的负责人要么行业内技术大拿，如何研发产品门清；另外就是销售出身的老板，什么产品可以获得销售，也比较清楚，但仅仅是知道什么产品可以销售，而不是产品满足市场需求，这两者有较大的差异。满足市场的需求有两个方面。第一，产品是临床检测所需，可以满足患者的检测需求；第二，产品满足临床检验的需求，比如操作的便利性、检测结果输出的快捷和准确、产品性价比高等，不在此一一列举，后续可以专项描述产品研发的需求。

2、产品的市场需求确定后，那就是产品的立项，确定产品的检测技术平台和检测方法，基因甲基化检测平台目前都是基于分子检测平台，方法有2种，荧光PCR（含熔解曲线法）和测序法。本次主要以荧光PCR方法为主线。技术平台和方法确定后，即可进入产品研发阶段。

3、在研发进行的同时还需要确认产品是否可以按照创新医疗器械进行申报，如果属于创新医疗器械，可以按照国家药监局2018年第83号公告《创新医疗器械特别审查程序》进行特别审查，可以加速对应的产品审评审批进度。另外按照《医疗器械监督管理条例》第三十五条，“对国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，符合条件的医疗机构根据本单位的临床需求，可以自行研制，在执业医师指导下在本单位内使用”。是否意味着如果属于创新产品，既可以找临床合作单位，一方面为临床试验准备，另一方面也可以进行LDT的尝试，在产品性能符合要求的前提下，先进入市场试水LDT检测。

从目前所获批的17个甲基化检测试剂盒，除了产品有重合的外，几乎都是以创新医疗器械进行申报注册。

4、研发阶段产品研究的本身需要的关键点包括如下几个方面：

（1） 主要原材料包括：引物、探针、PCR反应液、反应酶、基因组DNA等。确定引物、探针的序列以及设计，PCR反应液的的组成配方、反应酶的配方、基因组DNA的提取纯化方式等，需要明确以上原料的获得方式是外购还是自制。确定获得方式，如果外购需要确定供应商，需要对主要原材料进行功能性试验筛选，并制定主要原材料的技术要求和质量标准，以及检验方法，研发过程使用的原材料必须是检验合格的原材料。

（2） 企业参考品的设置。按照荧光PCR的产品要求，一般会设置阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品和检测限参考品。阳性参考品一般包含一定DNA浓度的检测靶标位点基因甲基化样本，如果是多位点检测，需要考虑不同样本的比例。阴性参考品一般设置为检测位点，无甲基化的DNA样本，另外也可以为检测位点甲基化DNA样本，但是甲基化的比例低于检测限。精密度参考品位一定DNA浓度下，检测位点基因甲基化检测位点，如果是多靶标位点，需要考量甲基化程度不同的情况。检测限参考品的设置一般略高于产品检测限的甲基化DNA样本。

（3） 生产工艺和反应体系研究。通常包括试剂盒反应体系的研究，包括引物探针浓度的确定、PCR反应液的选择和配方、阴阳性质控品的选择和配方；在PCR反应程序中需要关注退火温度的选择，退火温度决定了扩增的性能；在此还要确定产品的适用机型的研究，确定反应程序以及扩增条件，通过功能性试验，确定最终的反应体系，在确定试剂盒的组分，确定产品的生产工艺流程和生产工艺，比如PCR反应液的配制、阴性对照品的制备等等。

（4） 分析性能研究在通过不同的适用机型，研究产品的准确定度（阴阳性符合率）、精密度、检测限、分析特异性，如果包含核酸提取部分，还需要研究核酸提取试剂的性能。准确度研究需要采用三个批次的试剂盒，在不同机型上进行检测，如果涉及多靶标位点检测，还需要进行不同浓度的靶标位点DNA的交叉检测，准确度需要达到100%。精密度检测需要三批次试剂盒的批间/批内、日内/日间、不同操作者之间的差异，必要时包括不同的实验室，其Ct值之间的CV＜10%。检测限需要不断验证产品对DNA样本浓度的检测，一般验证会持续到0.01ng/uL左右，视具体产品而定。特异性研究则选择非靶标位点的甲基化DNA进行验证，通常可以选择子宫颈癌、胃癌、食管癌、胰腺癌等，必要时包括肠息肉、肠腺瘤、肠炎等特异性样本进行研究。

（5） 阴阳性判断值研究先在内部检测初步确定一个值，后续根据临床样本的验证，再确定最终的阳性判断值。

（6） 稳定性研究包括长期稳定性、使用稳定性（开瓶、冻融、热稳）以及样本稳定性研究（如果样本有不同类型，还需要进行不同类型样本研究）。

二、临床评价。至少选择3家临床试验机构展开临床试验。

1、性能评价。采用体外诊断试剂与临床参考标准进行比较研究，评价试剂诊断的灵敏度、特异性。一般入组的病例是检查结果为确定的病例或者癌前的疑似病例。病例尽可能分为不同分期的癌症患者，甚至包括癌前病变和类似常规疾病、癌症患者的患者病例（参考性能研究中特异性样本的病例）。病例的最低接受标准可以参考结直肠癌，结直肠癌病例建议不少于300例，其中各分期病例建议I期不少于80例，其他各期分别不少于50例；结直肠癌前病变期病例中进展期腺瘤建议不少于200例；肠道良性疾病患者中，肠息肉患者建议不少于200例；其他各种癌症病例建议分别不少于30例；肠道无占位性病变患者不少于230例。

2、样本类型和临床评价指标与统计。样本类型包括预期用途包括的所有样本类型，比如血浆、血清、粪便等。临床试验结果进行总结，需计算灵敏度、特异度的95%置信区间。针对不同病程分期、类似癌症、常规类似症状疾病的病例也需要进行特异度分析，并计算95%置信区间。

3、基因甲基化检测性能评价。针对所有被测基因，建议采用境内已上市同类产品作为对比试剂，采用试验体外诊断试剂与之进行比较研究。如该基因甲基化检测尚无同类产品上市，可采用适合的基因甲基化检测实验室参考方法作为对比方法，例如Sanger测序法、NGS、数字PCR等。采用四格表方式对临床试验结果进行总结，计算阳性符合率、阴性符合率和总符合率，并计算95%置信区间。如为多项基因甲基化联合检测，应针对不同基因甲基化分别估算样本量，并分别进行统计分析。

4、手术前后基因甲基化检测评价。对于尚无同类产品上市的产品，开展临床试验时建议入组一定数量罹患结直肠癌或癌前病变、且治疗前本产品检测为阳性的患者，收集其手术前后的样本，采用试验用体外诊断试剂进行检测，评价术后阴转百分比。对于未见阴转的病例，应结合患者疾病治疗效果进行合理分析。术前术后采样时间应结合疾病发展规律及治疗后监测时间要求进行科学设定，建议收集患者手术后半年内的样本进行检测。此部分样本量建议不少于40例。

三、注册报批。整个流程目前都是按照创新医疗器械审批流程进行审批的，监管和审批部门都会提前介入，在符合法规要求、不缺少审批流程、不省略审批资料的基础上加快审批过程。按照目前的流程，正常注册申报整个流程大约在1-1.5年左右。

四、生产申报。获得产品注册证后，在监管部门网站上进行对应的生产许可申请，市级（含区）监管部门会视情况确定是否进行现场核查，再核准生产。

以上基本是肿瘤早筛基因甲基化检测试剂盒的整个过程，由于目前此类产品也属于创新阶段，监管部门也在不断完善对应的监管法规要求，在实际运作过程也会有相应的法规出台，我们也只能摸着探索着前行，正如那句话：路虽远，行则将至。