白话胶体金系列——第六话<为什么要调节标记的pH？>

一、调节pH的目的：

    在不同pH梯度下标记，胶体金会表现出不同的颜色变化，前面烧金那里介绍过，胶体金粒径从小到大，对应的吸收峰会发生红移，也就是说吸收掉的光是由紫到红的变化，而我们观察到的反射光的颜色会由红往紫方向改变。标记过程之所以发生颜色变化，也是因为胶体金颗粒大小的改变。而在烧金的时候，所有金原子都参与组成胶体金了，所以标记时候的颜色变化肯定不是胶体金颗粒本身大小的改变，只能是聚合的结果。也就是颗粒只能增大，对应的颜色只能往更紫的方向变化，所以我们能观察到标记pH从高到低的梯度下，胶体金由最初的红色，变得更红，进而变紫红，到紫，深紫、蓝紫色，如果颗粒再聚集增大的话，所有光都被吸收，没有反射光了，就变成黑色了。

    结合几个动图演示来看一下，在加蛋白之前，溶液中的胶体金开心的做着布朗运动，即使两个胶体金碰了面，也因为负电斥力而互相弹开，保持分散稳定。溶液显示透亮的红色。

    在理想的标记pH条件下，蛋白Fc端带少量正电荷，Fab端带等量的负电荷，蛋白整体电荷为0，这样Fc自然结合到胶体金，同时Fc疏水基团较多，跟金紧密结合，而Fab因为负电斥力，自然伸展到外层，结合位点充分暴露，同时保证整个标记物外层还是一圈负电荷，标记物互相排斥不聚集，结合物还是一起开心的做布朗运动。一个胶体金颗粒大小40nm左右，而文献上介绍IgG分子大约8-10nm左右，所以一个胶体金可以结合多个IgG，标记后的颗粒直径会增加，不同IgG抗体的差异可能较大，标记上蛋白后的胶体金或者荧光微球，其粒径一般会增加20-30nm。虽然粒径由40nm增大到60nm了，但是这种情况下，金子并没有聚集，胶体金还是40nm的，只不过穿了一件蛋白材质的外套，所以并不会变成60nm的紫色，但是结合物毕竟是身材发福了，吸收峰会稍微增大一点，溶液会表现出红色稍微加深了，这是对胖子起码的尊重。

    当然这是理想的状态，但是我们知道蛋白在等电点时溶解度最低，也就是PI时，蛋白之间没有斥力，本身容易聚合沉淀析出，而一般情况下，聚集都不是我们想要的结果，尤其是不可控的聚集，所以通常我们更希望蛋白本身还维持一定的相斥稳定，而带正电荷又会引起金子聚集，所以我们调节的方向只能是让蛋白整体显示一定的负电，保持蛋白本身稳定，又避免过度标记聚集，同时这个负电斥力不能太大，以免影响蛋白和胶体金的结合，因此可以得出稍高于等电点的这个结论，这也是很多文献都喜欢提到“PI+0.5”的原因。了解了这个推论的由来，我们也就不用太纠结了，我们只是选择一个合适的标记pH条件，不需要确切的知道PI，也不需要严格控制PI+0.5的pH梯度，这些是用于描述理想标记条件的，而不是必须的精确标记条件。

    我们再来看一下使蛋白刻意带很多正电荷的结果，在这种情况下，一个蛋白可以结合多个胶体金，而一个胶体金本身就可以结合多个蛋白，那么导至的结果就是形成了三五成簇的聚集颗粒，两个胶体金聚在一起，红色金就会变成紫红色，如果再翻倍4个金聚一起了，颜色就是紫色了，再翻倍8个金聚一起就是深紫色，再翻倍那16个金聚一起就成蓝色了，再翻倍32个金聚一起，那就变成黑色沉淀下来了。粒径测试结果也证实了这个推论。所以虽然蛋白是通过正电荷与金结合，但是我们调节pH的目的并不是刻意使蛋白带正电，这里不要受远古文献的误导。

    如果蛋白带很多负电荷，那就是下图了，带负电的抗体飞上天，与带负电的胶体金肩并肩，而不是手拉手，大家一起开心的做布朗运动。表现就是随着标记pH升高，胶体金始终保持红色，标记物的活性降低，极端情况下，蛋白负电荷太多，与金完全相斥，不发生结合，做成条子连配套的C线都出不来。

    所以我们调节标记pH的目的，是使蛋白有合适的负电基团与胶体金保持轻微相斥，不至于交联死金，从而维持标记环境的稳定；同时有足够的正电基团与胶体金正负相吸结合，保证高的标记效率；另外还要考虑生产过程中的风险，对后续离心和释放的影响，对产品灵敏度和长期稳定性的影响，还要给放大生产留出余地等等。因此调节pH是标记的重中之重，在讲标记之前特意先提出来。可以说，做出来一个好的标记物，产品基本上就八九不离十了，标记也是最影响产品性能的环节。

    前面提到了紫色、蓝色、黑色等是由胶体金聚集导至的，一般是要规避的，但层析这个肉眼判读的模式决定了，只有积累到一定量的颗粒，形成肉眼可见的信号，才可以判断成阳性，才有资格谈性能。虽然T线那里形成了免疫复合物，拦下来胶体金，但是如果达不到肉眼识别出来的基线，跟没结合一样。

    这就导至了颗粒越大，可观察到信号的基线越低，给人感觉灵敏度越高。比如T线抗体抓了10个抗原，这10个抗原分布在10个胶体金标记物上，对于不聚集的情况，就是T线拦截了10个胶体金，其形成的信号不足以被识别，但是如果这10个胶体金标记物是聚集的，相当于拦下来20个胶体金，那可能就看到线条了。如果聚集的更严重，拦下来5个抗原就相当于T线拦截下来40、甚至80个胶体金，就可以更明显的形成肉眼可见的信号。所以对于同一对原料，在特异性很好的前提下，标记颗粒越大，灵敏度越高，40-60nm的会比20-30nm的金灵敏度高，乳胶颗粒更大，一般比胶体金灵敏度更高，标聚集的金会比不聚集的高，甚至强于乳胶的。这也是为什么很多公司产品的T线可能是红色、紫红、深紫、甚至黑色的，其对应不同的胶体金聚集程度。

    死金是一个比较直接的提升信号的手段，所以很多人在用。但信号的提升不等于灵敏度的提升，很多时候，信号的提升只是提前积累了一定量的非特异信号。就比如让你喂乌鸦喝水吧，一个水瓶，里面有半瓶水，乌鸦够不到，一种做法是往瓶子里灌水，到达乌鸦能够到的位置，这完全是水特异性的增加导至的结果，这种做法保险靠谱，虽然费时费力、增加成本。而另一种方法，你扔进去几十颗石子，水面也上涨到乌鸦能够到的位置了，但是这里面不光有真正想要的水，还有杂物石子，甚至有沙土，这些都不是我们想要的，我们像走钢丝一样让他们刚好托举了水面又不让水变得特别浑浊，但是说他们不会污染水，乌鸦都不会信，并且纯粹的水始终只有那么半瓶，水并没有增加，也就是特异性的信号还是那么点，站在非特异的肩膀上，刚好被识别出来了，而非特异往往更容易受到反应环境的影响，时不时的自己就冒出头来了。

    所以不建议大家剑走偏锋，为了灵敏度都去追求聚集的条件标死金，其弊端很多，首先就是特异性问题，然后层析的问题，稳定性的问题，生产可控性问题等等，一大堆问题。好的标记技术路线，还是要追求“稳定、高效”。

二、为什么不推荐NaCl滴定法

    上一话讲了：“一个最佳Ph实验，需要一个完整的生产、检验过程，不要奢望看个颜色，加个NaCl就出结果了，想想我们优化Ph的初衷——稳定、高效，首先是获得一个稳定的标记物和稳定的生产过程，也就是从头到尾不死金，再一个就是产品的性能符合要求。标记物再稳定，产品性能不合格，也是枉然；性能合格，操作重复性或产品稳定性差，也是白瞎。”

    我们来看一下NaCl滴定为什么不适用（NaCl滴定的原理，是基于盐离子对疏水胶体稳定性的破坏作用）。

    首先，低标记pH下，蛋白会带更多的正电荷，金标物之间的斥力会比较小，但这时标记的效率较高，而高标记效率往往是我们追求性能时所需要的，这时我们如果加NaCl进去，会破坏本就脆弱的斥力，进而出现死金现象，但是在正常操作时我们会用BSA进行封闭，这个封闭不仅能封闭金子表面，更重要的是，他使金标复合物带了更多的负电荷（BSA低等电点），使标记物更加稳定。所以，NaCl法没有考虑到封闭的稳定作用，NaCl滴定不稳定，不代表封闭后也不稳定；再一个，NaCl滴定会误导我们选择性能较低的条件（ph偏高一些），当然这也有一点好处，就是选择高的标记ph条件对放大生产的稳定有利。

    上面这种情况是NaCl滴定能够得以顺利实施的情况下表现出的缺陷，在其他一些特殊情况下，NaCl滴定法可能没办法实施，比如，标记后的复合物本身斥力足够大，你又过量标记，加NaCl进去都不变色；又或者金子质量太差，或原料特殊，加进去NaCl所有条件都变色，甚至不加NaCl大部分条件都变色，这时你如果跟随NaCl的脚步，不一定带到哪条沟里去了，纠结于此往往不能发现背后真正的原因和解决方法。

    对于部分IgG1型的抗体，NaCl滴定选择的条件会接近性能实验结果，但即使都是IgG1型抗体，标记、离心时的表现也会有很大差异，所以优化标记应以稳定高效的性能目标为指导，抛弃文献中的NaCl滴定法。

三、关于调节金子pH：

    常用的是碳酸钾梯度调节，pH随着加入体积的增加而升高，这是一个相对连续的调节方法。有些公司使用缓冲液调节Ph，方法是加入相同体积、不同Ph的缓冲液，比如加入1/20的7.2的PB、8.0的BB、9.6的CB等等，这是一种跨步式的调节方式。两种方式调节均以加入量为参数，不必纠结具体的pH数值，当选出最合适条件后，可以想办法检测一下这个点的Ph数值，在生产中作为一个质控点。

    碳酸钾调节的优点是可以细化很多Ph梯度，从而利于追求性能，缺点是过于追求性能情况下，在临界状态附近放大标记，容易出现死金。并且碳酸钾本身是盐，对金子有一定的破坏作用。

    等比例放大，标记的整体pH环境相同（1ml和几百ml，操作无错误，最终的胶体金pH是一样的），那为什么小量标记没事，放大会死金呢，这是一个比较困惑的问题，可以从两方面理解（这只是我的推论，有助于理解现象）：

    一是“狼多肉少”，胶体金是狼，蛋白是肉，少量标记时，假设在反应中心，1个金子标记上了蛋白，这时在反应区域外有9个等待标记的金子虎视眈眈，他抱着蛋白往外突围，走一步撞上1个金子，对方说“队长，别开枪，是我”，原来他走的同时，对方也标记上了蛋白，这时竞争比例变成了2:8，再走一步，比例变成了5:5，他最终突围出包围圈后，所有金子都标记好蛋白了，突围过程很从容，大家谁也不会抢谁的，相安无事。但是放大标记后，他突围了一层包围圈，遇到的是新的一批未标记的金子，再次勉强突围后，迎接他的又是新的一批没标记的金子，谁也别废话了，动手吧，最终抢来抢去，一个蛋白连上了多个金子就死金了。也就是放大标记中，整体Ph环境一致，蛋白的结合倾向是一致的，但是从反应中心扩散到整个区域的过程中，一个蛋白需要面对更多的金子的争抢，所以放大标记比小量标记容易死金。

    另一个原因是局部pH降低，加入蛋白意味着引入了缓冲液（蛋白保存液），一般蛋白的保存液是PB，会拉低局部的pH，放大标记，加入的蛋白保存液量明显增加，在这个局部反应区域内，蛋白是在低pH环境下标记，更容易死金。

    以上通用的解决办法就是要把标记pH提高一些，在临界状态之后，性能满足要求的前提下，尽量往高提，能提高多少视蛋白结构和金子浓度而异。高倍金放大死金的风险远远高于常用的1/万金。

    而缓冲液标记放大死金的风险相对较低，可能有两方面原因，一是本身缓冲对的缓冲能力大于单纯的碳酸钾，二是已经人为的加大了pH的跨度（相当于碳酸钾梯度做大了，你选择的最优点已经是远离临界状态的安全点了）。

    本话完。