白话胶体金系列——第五话<标记>

好久没更新了，看到还有新增的粉丝，感觉不写点什么对不住大家的厚爱，我慢慢写，各位慢慢看吧。声明一点，写作纯属个人爱好，谢绝各种商业公众号转载。

一、胶体金标记蛋白的作用力：

    胶体金标记蛋白是物理吸附的结合，有三种作用力参与其中，了解这几种作用力，有助于理解标记时调节pH的意义：

1.电荷引力：

    前面讲过，胶体金表面有负电层，而蛋白质由氨基酸组成，不同的氨基酸等电点不同，在一定的pH环境下带不同的电荷，有正电、负电或者无电荷，总的加权电荷就是蛋白质的整体电性，比如带负电的氨基酸比带正电的氨基酸多，蛋白整体就会显负电荷，但此时还有正电荷基团，可以通过电荷引力结合胶体金。

    不过，蛋白虽然是通过正电荷与金结合，但是我们调节pH的目的并不是刻意使蛋白带正电，这里不要受远古文献的误导。试想一下，如果一个蛋白带有很多正电基团，这些基团同时吸引结合多个胶体金，这些胶体金再去结合带正电的蛋白，再结合胶体金……，这样循环下去，就会形成交联死金的情况，表现就是低pH条件标记（蛋白带正电荷），胶体金会变紫、变蓝甚至变黑沉淀。

    当然标记pH也不能太高，太高了蛋白本身正电基团减少，蛋白与胶体金负电斥力增加，两者很难接触到一起，表现就是随着pH的继续升高，胶体金始终保持红色，但是标记物的活性降低，极端情况下，蛋白负电荷太多，与金完全相斥，不发生结合，标完了连配套的C线都出不来。

    所以我们调节标记pH的目的，是使蛋白有合适的负电基团与胶体金保持轻微相斥，不至于交联死金，从而维持标记环境的稳定；同时有足够的正电基团与胶体金正负相吸结合，保证高的标记效率。因此Ph需要在一个合适的范围，一般可能是稍高于等电点一些。

2.疏水作用力：

    这种力在免疫反应中的作用最大最强，对于维系复合物稳定起到主要作用，而胶体金与蛋白的稳定吸附也很依赖疏水作用力，如果说之前的电荷引力是相亲，第一眼的印象很重要（同性相斥，异性相吸），那么疏水作用力就是领证，维系稳定的婚姻关系（强力、长期），所以对于标记来说，除了pH外，表活的存在也会严重影响标记效率，因此标记时不能加表活，烧金、标记的玻璃器皿也最好别用含表活的洗涤灵清洗。

    早期论坛里有一种说法，说调pH到等电点附近时，折叠在蛋白内部的疏水基团会暴露出来，增加与金的疏水结合。这个说法我没找到相关的文献支持，说说我的理解：

论坛这个说法可能是源于蛋白盐析和等电点沉淀法的原理，蛋白质一般在等电点时溶解度最低，在等电点外的pH环境下，因为蛋白上面带同种电荷相斥和水化膜的保护，能够稳定溶解，但在等电点时蛋白的净电荷为0，斥力消失，蛋白容易碰撞到一起，因疏水残基互相结合而析出，如果再加入盐蓄意破坏水化膜，蛋白就稀里哗啦的沉淀了。但这些疏水基团并不是在等电点时才由内部露出来的，虽然蛋白的大部分疏水基团折叠在内部，但是仍然有疏水基暴露在水中（数量不一，多的据说有约1/3），也就是在等电点时，没有了斥力，蛋白表面的疏水残基容易发挥作用，而不是在等电点时才暴露出疏水基团。

    从这里引出的另一点推论是，疏水作用力的发生需要疏水基团空间上足够靠近，如果有静电斥力存在，疏水基团碰不到一起，也就发挥不了作用了，这也就是说，标记时pH过高导至活性降低的原因，一是正电基团减少，电荷引力减弱，另一个静电斥力太大，疏水作用力很难发挥作用，综合结果就是结合到金子上的蛋白更少了。

3.金硫键：一个强大的作用力，以下引自涛哥的《桔林杂谈（3）—纠结的PI+0.5》。

  “为什么我们在实际探索最佳标记PH的时候，有的蛋白最佳标记PH并不符合这个规律？有的蛋白随着标记PH的升高反而表现出更强的特异性反应，或者特异性反应强度出现抛物线样的变化，或者······

     我们在解释PI+0.5时，并没有引入配价结合参与标记过程的机理。蛋白的半胱氨酸残基可以通过硫基与胶体金表面形成配位键，而这种结合作用力是非常强的，完全可以打乱上述规律。比如一个蛋白的氨基酸序列中含有相对较多的半胱氨酸残基，而这些残基分布在序列的多个位置上，牢固的吸附于胶体金表面，这样蛋白的特异性表位可能很难暴露出来。如果采用较高的标记PH，当斥力占绝对优势时，蛋白特异性表位将会暴露出来。反应在表观上，就是在一定范围内，标记PH越高，特异性反应越强。如果一个蛋白含有非常多的半胱氨酸残基，由于强大的配位键结合力，将会导至金标记物互相吸附，进而凝集、蓝变甚至沉淀。这可以解释，为什么有的抗原纯度虽然很高，也不含有干扰成分，但即使采用很高的标记PH，也无法标记成功。将抗原加入胶体金溶液中，即发生蓝变。

     另外一个典型的可以说明配位键对标记效果影响的例子是：硫柳汞，这也是胶体金产品中忌讳该防腐剂的原因。

     此时，我们会发现配价结合作用力与其它作用力对标记效果的影响，有时候会产生矛盾，而互相矛盾的作用力共同作用一个反应的时候，可能会出现抛物线样的性能表象。在抛物线的前后位置，代表了某种作用力更占优势，而在抛物线的顶端，是各种作用力的平衡点。

     在查阅文献资料的时候，我们还可能会看到一种说法，关于标记蛋白大致可以分为三类：PH非依赖型、PH非严格依赖型、PH严格依赖型。之所以有这种说法、出现这些现象，与三种作用力的共同作用有关。对于PH非依赖型和非严格依赖型往往与蛋白的氨基酸序列中含有相对较多的硫键有关。”

4.最后总结一下：

    调节pH一来直接影响电荷和疏水作用力的发生，二来可能改变蛋白的空间构想，因为蛋白质的COO-和NH3+这两种残基之间会形成电荷引力，这是维持蛋白三维空间构象的一种作用力，不同的pH条件，会改变蛋白的电离倾向，从而破坏这种作用力，使蛋白质的空间构象发生一定的改变。这种改变带来什么影响不好说，只能骑驴看唱本，走着瞧。 所以调节pH是标记的重中之重，在讲标记之前特意先提一下，其他的理论讨论就放在下一话进行了。可以说，做出来一个好的标记物，产品基本上就八九不离十了，但是要记住，产品的性能是由抗原抗体等活性原料决定的，标记物只是起到一种示踪剂的作用，让我们能观察和检测反应，他不能化腐朽为神奇，标记得好，并不能超越抗原抗体本身性质来提高产品性能，但是标记不好确实会影响性能的发挥，其他工艺调试也是如此，只是顺应原料本身的性质，最大化发挥原料的性能，没有万能的固定体系。过去圣人教学亦是如此，因人而异、各成其才，不能囿于成见、意必固我。新手做实验难免各种被虐，各种刷新认知，以前迷茫的时候跟涛哥聊天，印象深刻的一句话是:初期见山是山、见水是水，慢慢的见山不是山、见水不是水，最后见山还是山、见水还是水就算玩明白了。

二、标记操作：

1.标记容器：

    推荐用小玻璃瓶，可以泡酸洗净，而且不易吸附。缺点是离心的时候还得转移的离心管。如果图省事，也可以直接用离心管标记，离心管最大的问题是不干净，极端情况下，加金子进去摇晃几下，金子就死了，感兴趣的可以做个实验，拿十几个离心管，装好胶体金，其他什么都不加，用力摇晃，会发现金子颜色变化，严重的情况是金子直接变深紫、甚至变黑，轻微的情况是金子稍微偏紫一些，如果因为离心管不干净导至的死金，随机发生在标记过程中，那么结果会难以分析。所以离心管在用的时候，至少要用超纯水多冲洗几次，包括与胶体金接触的枪头最好也润洗几次。还有用枪混匀时，一定要慢吸慢放，快了的话，金子从枪头上行接触到枪末端，一个是对枪不好，再一个金子会死的很难看。

    另外值得注意的一点，离心管容易产生吸附，尤其是在用高倍金（比常用的1/万浓度高的金）标记的时候。当然这也有一定的积极作用，就是在标记过程中的细节现象有助于我们判断标记条件是否合适。比如下图这种，同一个原料，不同条件下标记，有的会产生明显吸附，而合适的条件可以保证离心管壁干净，代表标记过程稳定可控，这就可以帮助我们优化和选择更合适的标记条件。

2.最适pH：

1）取胶体金：准备7个玻璃瓶或离心管，每个加1ml胶体金，前6个用于实验，最后留一个空白，什么都不操作，用于对比观察。有经验后，或者大量筛原料的话，可以少做几个梯度。新手建议用1/万的金子练手，高倍金比如4/万，稀释4倍就是1/万的金子，这里说的万分之几都是基于氯金酸的质量百分比。高倍金标记更容易出问题，如果没有经验，不知道正常是什么样子，那么异常的现象也容易被忽略，除了最终的性能之外，我们很多调整策略都是根据各种实验现象来的。

2）调pH：分别加入0.1M碳酸钾0、2、4、6、8、10ul，加入之后马上充分混匀。注意：加进去碳酸钾要马上混匀，不然的话，碳酸钾会自然沉降到底部，导至局部离子强度过大，严重的情况会导至底部的金子直接死掉，变成黑色，而上面的金子是正常的红色，出现明显的分层现象，在用高倍金的时候更容易观察到。我们不必确切知道每个点的pH值，只需要拉出一系列的pH梯度。

3）加蛋白：分别加入10ug待标记原料，混匀，反应30min，多观察颜色变化。标记时间后续需要优化，可能需要延长，也可能需要提前终止，观察颜色变化有利于分析和解决问题。

刚加入的颜色可能是这样的：

过段时间，不合适的pH已经死金褪色了，临界点的pH会明显比其他的变紫，再后面高pH的没问题会依然保持红色，但是比空白胶体金颜色稍微加深。

4）封闭：分别加入10%的BSA 100ul，混匀，反应30min。再观察颜色变化，变紫色的有可能会轻微红回来，也可能死的更难看，这些都是调试的切入点。

5）离心：4℃，9000rpm，15min，上清尽量取干净。机器不同，金子大小不同，离心参数会有差异，具体根据离心效果看，上清干净即可。正常情况下，离心后沉淀稍蓬松，不是一个小黑点的样子，也不是一大片贴在管壁侧面。

6）复溶：一般1/10体积复溶沉淀物，可以悬浮后再离心洗一遍，有利于去除游离抗体，也可以直接喷金或者涂金，进行下一步的性能测试。用于悬浮或者保存金标记物的液体，需要高pH、低离子强度，外加保护性蛋白，洗液成分相对简单点，一般就是pH 8.5的Tris+1% BSA就可以了，铺金或者喷金液的话，至少还要加糖，否则金标蛋白会牢固结合到垫上无法释放。

    观察复溶过程中沉淀物的表现，有无不溶颗粒物或片状物等，有的话说明金子发生了聚集，可能是标记导至的，也可能是离心过猛了。正常情况下加入复溶液后，金子表现出上浮的絮状（下图一），不能加进去像一潭死水没反应，然后用枪头吹打混匀后，金子应该完全溶解澄清，底部没有不溶的小黑点。（下图二）

7）喷金：如果用3/万左右的金子，标1ml悬浮成100ul，一般可以出一整板，也就是喷3ul/cm左右就可以了。如果是1/万的金子，一般只能出1/3板，需要喷到6-9ul/cm，不然金子用量太少了，抗体也不足，反应很弱，结果不好观察。喷金借助仪器操作，如果省事，也可以选择手工涂金，把金垫裁成需要的尺寸后均匀涂抹。仪器喷金如下图，步进泵控制出液量，平台联动来均匀喷涂，除了出液量参数外，平台的移动速度、气压、喷笔高度还有金垫材质都需要优化筛选。

8）性能测试：与划好的膜一起组装检测，符合性能要求的前提下（或者性能相差不太大的情况下），尽量选择远离变色临界点的条件为最适pH。

    没错，一个最佳Ph实验，需要一个完整的生产、检验过程，不要奢望看个颜色，按文献加个NaCl就出结果了，想想我们优化pH的初衷——稳定、高效，首先是获得一个稳定的标记物和稳定的生产过程，也就是从头到尾不死金，再一个就是产品的性能符合要求。标记物再稳定，产品性能不合格，也是枉然；性能合格，操作重复性或产品稳定性差，也是白瞎。

3.最适蛋白量：

    类似于pH的过程，在最适pH点上，把标记蛋白量做个梯度优化，梯度范围1ml金子加5-20ug蛋白。无论是标记pH，还是蛋白量，筛选的结果一定离不开性能测试。

    优化标记量是因为免疫反应有比例性，夹心法一般标记量增加，一个金子上面标记上的蛋白就越多，与待测物反应后的整个复合物被T线捕获的机率也越高，灵敏度就越高。但也不是越高越好，在一定范围内标记浓度低有可能比高浓度获得更强的信号，因为同样数量的待测抗原分布到更多的金标记物上，T线可以拦截更多的金子来形成信号。另外标记浓度高了，游离抗体容易去除不干净，会引起竞争效应，灵敏度反而降低。而竞争法相反，标记量越低，金子上的抗体越少，与阳性样本反应后，金子上能结合T线抗原的抗体就越少，越利于消线，灵敏度越高。

本话完。