前 言 目前公认为，数字PCR的概念最早概念是1999年由Bert Vogelstein和Kenneth W. Kinzler发表在PNAS的文章中阐述的。两位最演示其实就是Rare Mutation Detection （RMD），将模板稀释到单分子，然后单独扩增，每个反应7 µL。但是这篇文章其实并没有提到现代数字PCR另外几个核心要素。
最近数字PCR似乎在体外诊断圈迅速火起来。今天微醺的炼金师也想凑凑热闹，和大家探讨一下数字PCR原理精髓：一个核心，一个分布，一个稀释；四个针对核心的问题。 我认为一个的核心指的是分区(compartment或者partition)。这就是数字PCR原理的核心。基本上分区的原理分为两个大的类型，油包微滴droplet，芯片chip 原理。但是在我看来这个区别没有必要刻意去做区分：在极端情况下，如果有人愿意，可以用8联管做分区，只要给他足够的模板，试剂和时间，可以做出和伯乐QX200一样的结果。实际上在2006年Fluidigm 发布的颇具数字PCR雏形的Biomark，也仅仅有765个分区。
其实Fluidigm的IFC48.48也很精巧，想想中间黑色区域有2304个反应，每个分区大小为10.1nL
数字PCR是如何从分区中量化结果的呢？不同于之前的实时荧光PCR，在反应的同时每次循环后读取荧光数值，数字PCR在反应结束后读取一次荧光数值，然后根据泊松分布计算出模板的量。
(Optolane’s 10k Dr. PCR) 这里引出泊松分布 泊松分布解决的问题，我用一个栗子给大家说明一下。假设有40颗松子，其中有20颗是坏的，小明不知道好坏，随机吃掉其中的20颗，问小明吃到10颗坏松子的概率？也许我们第一直觉想的也许是100%也许是50%。但是，根据泊松分布，小明大概只有12.5%的几率吃到10颗坏松子，有相似的几率吃到9颗或者11颗坏松子。有3.7%的几率吃到5颗坏松子，只有千分之1.8的几率吃的20颗松子都是坏的。这也符合我们大概的生活经验。
（预期平均值为10的柏松分布）
(Simeon Denis Poisson 1781~1840) 非常笼统的说，在模板足够多的情况下，一个分区内可能不止含有1个模板，可能是1个，甚至可能是5个甚至更多。根据泊松分布，如果有2万个模板进入2万个分区，仅仅有12642个分区会含有模板，剩下7358个没有模板。12642个分区中有7358个分区会含有1个模板，有3678个分区会含有2个模板，有1226个分区会含有3个模板，有306个分区会含有4个模板，有61个分区会含有5个模板。
再非常笼统的说，泊松分布就根据有荧光的分区和总分区的的数量来计算出实际的模板量。 一个稀释，叫有限稀释(limiting dilution) 就是字面上的意义：就是必须将模板数量降到不是所有分区都含有模板。想象这样一个场景：总共有2万个分区，2万个分区都有荧光信号，那就不能知道是10万个模板还是100万，还是1000万。就是模板饱和。这个刚好模板饱和的数值就是数字PCR的动态范围，可以笼统地想象为计量范围。 这里引出我认为针对核心(分区)： 第一个核心问题： 动 态范围 因为动态范围唯一决定因素是分区的数量，所以动态范围是“核心”的问题。动态范围是10万，就是数字PCR可以对10万以下的模板进行绝对定量，这个对很多做RMD的人已经远远超过检测限了；动态范围对RMD应用的另外一个影响是可以稀释野生型的浓度，提高变异型的浓度。而对于一些做微生物的人，10万以下的检测限也许会不够用…… 第二个核心问题： 除了分区数量就是分区大小 在我看来分区大小的重要性要远超于分区数量。原因一是泊松分布经过推演得出浓度的计算公式，明确了分区的大小成负相关。
原因二，分区大小其实直接和样本损失率相关。 第三个核心问题： 样本损失率 样本损失率不是对分区的描述，但是是在分区的过程中发生的。 想像这个一个场景：一份样本，只有一个模板，在样本损失率为50%的情况下，就有50%的几率检测为0(伪阴性)。 虽然即便是做RMD，检测阈值一般会会大于1，而且检测阈值越高，样本损失率会对结果影响越小。但是过高的样本损失率依然是增大误差的重要因素。
无论对任何一种检验，在取样时会产生取样偏差(Subsampling error)，而对样本损失，相当于在Subsampling上又做了一次Subsampling。 所以我对样本损失是深恶痛绝的。伯乐的样本损失率率在15%到17%之间，最近一次调整之后，我估计伯乐的实际样本损失率为20%。 第四个核心问题： 分区的大小均匀度 如果有的分区大，有的分区小，模板进入分区的概率就完全不同，这样泊松分布也不再适用。这样也会极大增加偏差。 所以综合考虑，分区的大小是“核心”的核心问题。
至此。我对数字PCR原理的核心-分区，分区的2个分布，4个对分区的问题的论述就到这里了。一家之言，如果有谬误，欢迎指正。 Reference 1. Digital PCR, by Bert Vogelstein and Kenneth W. Kinzler, PNAS, 1999 2. Technical note: Multiplexing with Optolane’s Dr. PCR 10k system. Sornkom et al. 3. Fuidigm Biomark HD Product Brochure 4. Fundamentals of Counting Statistics in Digital PCR: I Just Measured Two Target Copies–What Does It Mean? , Svilen Tzonev 5. Droplet Digital PCR Applications Guide |
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