王成彬 | 高通量测序技术在临床感染性疾病实验室诊断中的应用 ...

1. 临床微生物感染性疾病实验室诊断的重要性：实验室诊断是临床感染性疾病诊断最直接、最客观的证据之一。常规感染性疾病实验室诊断可分为感染相关标记物检测和病原体检测两大类。人体感染病原微生物后，由于免疫系统应答会出现一系列生理和病理反应，继而产生与感染相关的特异性生物标记物改变。通过检测感染特异性生物标记物可帮助临床医师进行感染性疾病的诊断或鉴别诊断、指导药物使用、评估病程进展和判断预后。因此，感染相关生物标记物的实验室诊断既是感染诊断的重要依据，也是治疗指导、预后评价与随访的重要参考。微生物培养结果是感染性疾病实验室诊断的金标准，既是感染明确诊断的唯一方法，也是感染用药指导的直接依据，因此在感染性疾病诊断中有不可替代的作用^［1］。

2. 临床微生物感染性疾病实验室诊断方法及问题：感染相关生物标记物可反映感染早期免疫反应和炎性反应，因此被作为感染性疾病早期诊断及预后监测的一个重要依据^［2］。常用的感染相关生物标记物包括C反应蛋白/超敏C反应蛋白、降钙素原、血清沉淀样蛋白A等，具有灵敏性高、可有效鉴别细菌性感染和病毒性感染的特点。随着对炎症生物标记物研究的不断进展，新的标记物被广泛提出，如：白细胞介素6、干扰素γ、肿瘤坏死因子-α等，大大提高了对感染性疾病实验室诊断的特异性及检出率。例如，白细胞介素6作为急性感染早期诊断、感染严重程度评价和预后检测的重要指标已被写入《感染相关生物标记物临床意义解读专家共识（2017）》中^［2］。但由于这些指标的非特异性（如C反应蛋白除提示炎症外，还与心血管疾病相关）以及在感染过程中的波动性，对于感染性疾病的鉴别诊断提出较大的挑战。共识中也指出，没有绝对灵敏又绝对特异的生物标记物，多指标的联合检测能更早、更准确地对疾病进行诊断或鉴别诊断，降低疾病误诊率^［2］。

传统病原体检测的代表性方法为细菌培养，仍被认为是诊断细菌感染的金标准，其优势在于分离培养的是活的微生物，可以进行菌种鉴定和药敏试验，便于指导临床诊疗^［1］。但是，细菌培养具有培养时间长、阳性检出率低、病毒不可培养等缺点，因此，以核酸、抗原、抗体为对象的病原体分子检测方法应运而生。近年来，与不同感染症候群相关的多靶标联合检测方法相继问世，如2022年获得国家药品监督管理局审查的脑炎/脑膜炎多重病原体核酸联合检测试剂盒获批上市，不仅提高了感染病原体检测的灵敏度，还大大缩短了病原体筛查的时间。但是，无论是基于细菌培养，还是基于靶向分子的病原体检测，都依赖于临床对感染性疾病症候的判断以及对临床疑似致病菌的经验性判断，因此，实验室诊断结果会受到检测方法选择的主观性影响。

伴随人类基因组计划的实施和完成，基因测序技术得到迅猛发展。测序技术是通过物理或化学的方法将DNA或RNA中的核苷酸物质进行逐一检测，并按其天然排列进行排序的一种检测技术。1975年，第一个基因测序技术——双脱氧链终止法，被行业定义为“一代测序”^［3］。相比于一代测序，二代测序（next generation sequencing，NGS）采用的是短序列平行测序的方法，可同时实现对数十亿条短序列（reads）的深度测序，因此也被称为“高通量测序”^［4-5］。通过对数十亿条短序列的生物信息学分析，可快速还原生物体的全部遗传信息，大大推进了对生命遗传物质的研究^［6］。

目前，高通量测序技术在基因组学、转录组学、宏基因组学等方面的医学研究和临床实践中发挥着重要作用。高通量测序技术已在多个临床方向开展应用，包括以染色体异常为检测对象的产前诊断和植入前诊断、以肿瘤致病或治疗相关的基因多态性为检测对象的肿瘤基因检测、以人体表观遗传改变为检测对象的疾病早筛、以微生物作为检测对象的感染性疾病的筛查和诊断。随着检测对象的复杂度升高，对于高通量测序技术临床应用和临床解读的难度也大幅提升，对技术开发和临床应用提出了更高的要求。

基于NGS方法的宏基因组高通量测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）技术是一种无偏向性，不依赖临床假设，通过检测样本中全部微生物的遗传物质（DNA和RNA），并通过生物信息的方法解析基因测序数据从而获得样本中的微生物组成，并从中分析与感染相关的感染病原微生物的检测方法。与传统方法相比，mNGS可以无偏倚地检出样本中的病原体（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫、支原体、衣原体等），灵敏度及特异度高，检测速度相对较快，特别是可用于其他传统手段无法检测的病原体，在新发突发感染、复杂及混合感染等疾病的诊断中具有极高的临床参考价值，在临床上具有良好的应用前景^［7-10］。

从临床应用看，mNGS可用于中枢神经系统急性感染、中枢神经系统病毒感染、慢性中枢神经系统感染、血流感染、疑难呼吸道感染、呼吸道重症感染、腹腔感染、关节假体感染等。但对mNGS的适应证，临床应有规范检测策略，与传统微生物检验及常规分子检测方法配合，适时进行mNGS检测。2019年以来国内发布了多篇专家共识，概括来说，mNGS的适应证主要包括：（1）危重感染；（2）免疫功能障碍；（3）难治性或既往疗效不佳的感染；（4）应用传统方法无法确定病原；（5）疑似新病原引起的感染；（6）群体性感染事件。考虑到mNGS的检测成本，且该方法目前尚无官方机构正式批准的适应证或推荐领域，因此，对送检样本和送检时机，推荐以下方法：mNGS检测多作为二线检测手段，但送检样本应与传统实验室检测时同时采样，并按样本类型及检测要求进行合理保存；慢性中枢神经系统感染时，mNGS可作为首选方案^［11-15］。

从检验技术看，mNGS测序和生物信息处理流程较为复杂，检测质量控制难度大。利用mNGS技术进行病原微生物检验流程较长，包括湿实验和干实验两个部分。湿实验是基因测序的过程，一般包括样本采集、样本前处理、核酸提取、文库制备、上机测序等步骤；干实验是对测序信息进行生物信息学分析，以确定病原体，一般包括数据质控、宿主信息过滤、微生物物种鉴定、阳性病原菌判定等步骤^［16］。目前，mNGS检测并没有统一的规范和质量控制原则，均由检测机构各自制定质量控制规则，从而导至不同机构间检测标准、检测结果的不一致性^［17］。针对这种情况，一方面要制定符合行业特点的检测质量规范、合格检测样本标准、科学报告格式，记录检测的质控数据，如测序质量、样本数据量、读长、微生物序列数和相对丰度等。另一方面要加强质控品相关的研发工作，开发可靠的阳性和阴性质控品，科学评价检测机构的能力；开发自动化基因测序平台、检测结果分析报告平台，不断推进检测质量建设。

检测结果解读也是mNGS技术临床应用中的一个新难题。大部分mNGS报告是以微生物序列数降序排列的形式呈现样本中微生物的组成。对于来源于无菌部位的样本，这种方式能够对判断病原体提供价值较高的诊断证据；当样本来自于肺部等有正常菌群定植的器官时，现有技术则不能准确鉴别定植菌和感染菌，需要临床医师结合患者病情进行进一步分析、判读。不同来源、不同类型的样本解读原则不尽相同，鲜见针对检测结果的解读规范，包括检测阈值、统一的临床标准等，需要检验、感染、专科疾病、生物信息分析、人工智能等领域人员的共同参与。应重视检测结果解读规范的建立，在临床工作中不断积累相关数据，开展不同来源样本的检测结果对临床诊断影响的研究，寻找解读的内在逻辑和规律，充分发挥检测结果的临床价值。应提高临床医师，特别是感染相关科室医师对测序检测报告的解读能力。并应不断探索人工智能在检测结果解读中的应用，结合微生物组成、患者体征、感染指标、影像学特征等数据，通过人工智能算法，探索多维数据与病原体诊断之间的关系，建立诊断模型，实现检测报告的自动化解读^［18］。

自新型冠状病毒感染暴发以来，疫情防控工作的根本原则是“始终把人民群众生命安全和身体健康放在第一位”。高通量测序技术能够切实加强临床感染性疾病的诊断水平，提高感染性疾病的防治能力，践行健康中国战略，具有广阔的发展空间。

1. 建立新技术规范化转化体系：国务院、科技部、发改委等多部门陆续发文，支持诊断技术创新，推进分子诊断系统、体外试剂产品的研发。2021年新修订的《医疗器械监督管理条例》规定，对国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，符合条件的医疗机构根据本单位的临床需要，可以自行研制，在执业医师指导下在本单位内使用。高通量测序技术用于感染性疾病诊断是新型诊断技术在临床重点学科上的应用实践。应积极支持实验室自建检测方法，探索建立mNGS医学检验诊断数据质量控制体系与标准，鼓励开发“整合式”平台技术，研发高端检验检测一体化设备和智能化等关键技术。

2. 检验医师参与多学科会诊：高通量测序技术的应用，可以快速明确病原微生物种类，实现从经验治疗向靶向治疗的转变，使患者在最短的时间内获益。需要多种交叉学科的参与，包括检验技术、临床微生物技术、感染诊断技术等，因此，具有相关专业背景的检验医师在实验室诊断中的作用尤为重要。对于疑难感染的多学科会诊，需要具有高通量测序技术经验的检验医师参与。此外，从分级诊疗的角度考虑，广大基层医疗机构面临更大的感染性疾病带来的临床压力，而且其传统检测能力较弱，诊疗经验与三甲医院存在一定差距，是抗生素不规范使用的重灾区^［19］。因此，基层医院对提升病原微生物诊断水平，提高抗生素靶向治疗能力具有更迫切的需求。基于医联体医院或互联网医院下的多学科会诊将打破信息孤岛效应，助力基层医疗机构对感染性疾病的病原学诊断能力的提高，有助于基层医院感染性疾病的精准治疗。

3. 发展方向：高通量技术在临床病原微生物检测方面的应用日趋成熟，其临床应用价值不断提升的同时，仍存在进一步优化的空间。目前测序获得的信息主要用于微生物物种的鉴定，由于基因组覆盖度的问题，在常规的检测中对微生物耐药基因和基因突变的鉴定能力较差。在科研领域采用扣除宿主背景联合高深度测序的方式，可以实现这些基因的检测，但成本太高，同时还存在耐药基因与耐药表型一致性的问题^［20］。因此微生物耐药性的检测是高通量测序应用亟待解决的重点问题之一。另外，随着技术的进一步发展，可以进行样本宏转录组学测序（metatranscriptomic next-generation sequencing，mtNGS）^［21-23］。mtNGS技术可以将病原的鉴定范围扩展到以RNA为遗传物质的微生物，可以获取样本中所有的转录组信息，从而对病原微生物的功能和人体免疫状态有更深入的认识，使疾病的诊断更加精准。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突