Science advances: “抗体开关”，实现血浆中小分子的持续生物传感监测 ...

主要内容

在抗体开关设计中，IgG抗体被设计成一个分子开关，抗体与含有分子“诱饵”的DNA支架特异性连接，靶抗原和分子“诱饵”之间可发生竞争性结合(下图A)。当游离抗原取代结合的诱饵时，导至系统发生构象变化。通过基于FRET的荧光可知晓开关的构象变化，从而达到连续测量目标浓度的变化的目的(下图B)。在没有靶标的情况下，连接的诱饵分子通过分子内相互作用与抗体结合（KDbait）；当靶标存在时，分子内反应和抗体-靶标结合(KDtarget)之间的竞争导至结构从封闭状态(高FRET比率)切换到靶标结合状态(低FRET比率)。诱饵和靶标在结合后都能与抗体分离，从而实现可逆的开关和信号传导。

虽然所选抗体的亲和力是固定的，但可以调整分子内反应的强度来控制开关的整体灵敏度。如果诱饵分子与靶抗原相同，则分子内诱饵结合强(低KDbait)，使平衡向封闭状态转移，导至低靶敏感性。相反，不匹配的诱饵分子具有更高的KDbait导至竞争减弱，对目标更敏感，但如果抗体-诱饵结合过弱，则导至较差的信噪比，这意味着需要仔细选择诱饵来平衡强烈的FRET信号和对低目标浓度的敏感性。

作为概念的初步证明，作者开发了一种抗体开关，可以识别DIG，一种植物来源的类固醇分子。同时选择DIG作为靶分子和诱饵分子，表明分子内诱饵强结合(低KDbait)，代价是较低的开关灵敏度(高EC50)。

作者发现DIG多克隆抗体(pAb)在构建抗体开关方面表现出优异的性能，与DIG-DNA结合KDbait为5.6 nM，表明DNA的附着没有明显破坏DIG抗体结合界面(下图B)。游离DIG略优于DIG- DNA；对于10 nM的DIG-DNA，5.8 nM的DIG可取代一半的结合DIG-DNA(下图C)。作者随后合成了完整的抗体开关结构(下图D)。正如预期的那样，随着DIG浓度的增加，FRET比率下降(下图E)。将FRET响应拟合到Hill结合模型可知传感器的Hill系数(n)为0.51，EC50为64 μM。该开关对DIG浓度变化的响应跨越超过10,000倍的动态范围，检测限(LOD)为68 nM。

接下来，作者评估了抗体开关在复杂生物流体中连续生物传感的适用性。结果显示未稀释血浆中的开关响应几乎与缓冲液中的相同，LOD为68 nM，动态范围基本不变，其中EC50 = 87 μM， n = 0.43(下图A)。

快速和可逆地传感目标浓度变化的能力对于连续传感器也至关重要。作者在3小时的实验过程中将抗体开关反复暴露于高浓度的DIG (1 mM)缓冲液与无靶缓冲液中。结果显示可逆和可重复的FRET转换，包括三个靶标添加和洗脱周期(下图B)。

作者选择了一种皮质醇的单克隆抗体，然后筛选诱饵分子(下图A)。含有皮质醇的诱饵-DNA (Cort-DNA)表现出较低的KDbait 1.8 nM（下图B），并与游离皮质醇激烈竞争，在10 nM诱饵-DNA存在下，需要41 nM皮质醇才能实现50%的结合位移(下图C)。相比之下，皮质酮诱饵-DNA (CSO-DNA)表现出更高的KDbait 4.7 nM ，需要5.8 nM的游离皮质醇就能达到10 nM的CSO-DNA的等效位移。

作者进行模块化构建抗体开关。结果显示Cort-DNA开关实现适度的皮质醇敏感性,从340 nM的LOD到最大测试浓度3.3mM。相比之下,CSO-DNA开关敏感性增强~ 100倍，LOD为3.3 nM和测量上限95μM（下图D）。这意味着CSO-DNA开关可能更适合于监测临床相关的皮质醇浓度。

与DIG应答性抗体开关类似，CSO-DNA开关在复杂的生物流体中表现出强大的可逆性和特异性(下图E)。在鸡血浆中测试了抗体开关，LOD为140 nM(下图F)。比在缓冲液中观察到的敏感性要低，且在血浆中的FRET响应幅度降低。尽管存在这些复杂的因素，但这些结果证明了抗体开关设计作为在复杂介质中实现连续生物传感的工具的价值。

最后，作者评估了抗体开关与基于光纤的生物传感器结合时的连续传感性能。该光纤传感器放置在~ 50 μl的样品室中，收集和测量固定在传感器表面的抗体开关发出的光。作者连续测量了>3小时的FRET响应。结果显示，抗体开关对皮质醇浓度的急剧上升和下降非常敏感，在约10,000倍的动态范围内，检测低至10 nM和高至100 μM的靶标。且传感器在目标浓度增加和减少的许多循环过程中保持稳定的基线。

作为概念的最后证明，作者测试了抗体开关生物传感器在99%的人类全血中直接检测生理皮质醇的性能，而无需制备样品。在45分钟范围内，作者测量了三个独立制造的传感器对健康人类供体血液中皮质醇增加和减少的重复周期的响应(如下图)。结果显示，传感器捕获了这100 nM皮质醇的增加和减少，并且对每次浓度变化的响应在5分钟内完成。虽然存在传感器响应不一致以及信号退化等问题，在未稀释的全人血液中连续检测生理皮质醇峰值的能力是一个重要的进步，为未来在未稀释的生物体液中开发更强大的性能奠定了基础。

抗体开关设计提供了一种将现有抗体设计成能够实时连续生物传感的目标响应分子开关的方法。这些开关表现出理想的生物传感特性，包括宽(~10,000倍)动态范围，快速动力学，可逆性，以及在未稀释的生物流体中直接感应目标的能力。抗体开关的设计也是模块化和通用的，因此它可以通过交换抗体和诱饵分子来适应广泛的目标。初步结果表明，抗体开关可能为开发基于开关的连续生物传感器提供一种通用而可靠的方法。

该系统的未来迭代可以实现更广泛目标的连续传感，包括肽甚至小蛋白质。在抗体开关组装过程中，支架的长度可以很容易地进行修改，因此应该容纳更大的肽或蛋白质为基础的诱饵分子，以感知这些靶标。然而，抗体的固有特性将对灵敏度施加基本限制。此外，连续测量的时间分辨率也受到抗体off-rate的限制。通过筛选更快的off-rate抗体和使用新兴的计算方法来仔细优化传感器，可以促进低丰度分析物的连续传感应用的发展。其次，生物污垢对整个生物流体的稳定传感仍然是一个重大挑战。稳定表面生物传感器的策略，如膜保护，高性能化学钝化策略等或可以大大提高传感器在体内的性能。

此设计提供了一种将抗体转化为传感器结构的通用策略，仅需要最少的筛选工作，并且无需对抗体蛋白本身进行任何工程设计。因此，作者相信这种抗体开关方法有可能加速各种连续生物传感器的发展，用于生理监测和改善患者护理。