IVD新技术丨快速、多重检测的对流阵列PCR（caPCR）

作者通过将被动对流PCR与DNA探针阵列相结合创建了对流阵列PCR（convective array PCR; caPCR），提高了PCR性能。该技术将分析运行时间从大约2小时缩短到大约30分钟，并极大地提高了每个反应的多重检测至数十个靶标，同时赋予caPCR读数的单核苷酸特异性。尽管单核苷酸分辨率可以在许多情况下提供有价值的信息，但个体遗传变异或病原体进化可能导至单核苷酸分辨率的核酸检测失败。因此，在基于核酸的检测中，必须能够在单核苷酸水平上区分序列的检测方法，同时在存在SNV的情况下，也应能提供一定程度的检测的能力(下图)。

作者在caPCR中引入了一个逆转录(RT)步骤，创建了一个单管RT-caPCR试验，用新设计的toehold介导的链置换（TMSD）探针能量学来扩增和分析RNA样品，从而可根据需要赋予目标序列敏感性和特异性（如下图）。RT步骤在相同的环形腔中在较低温度下进行，以允许cDNA合成，然后使用caPCR循环条件进行cDNA扩增。作者系统地设计了基于toehold介导的链置换（TMSD）探针的检测，以实现满足不同功能标准的一系列能量组合，从而创建具有可调节序列选择性的链置换探针，既可以耐受突变，也可以对突变敏感。单核苷酸变异(SNV)鉴别探针允许在只有一个核苷酸差异的目标之间进行区分，而稳健探针甚至可以在探针区域内存在多达2个核苷酸错配的情况下检测目标，作为一种特异性较低但比SNV识别对应物更敏感的读数。

作者将RT-caPCR结合稳健探针和SNV鉴别探针应用于呼吸道病毒检测。使用定制的MATLAB脚本处理来自RT-caPCR系统的探针阵列图像，以识别存在的病毒靶标以及SARS-CoV-2的变体。结果证明了RT-caPCR能够同时使用稳健探针进行灵敏的检测，以及SNV鉴别探针对靶标进行单核苷酸分辨率的识别。

作者创建了一个完整的panel，包括稳健探针和SNV鉴别探针，用来了筛选已知的所有7种冠状病毒(HCoVs 229E、HKU1、NL63和OC43；MERS-CoV, SARS-CoV-1和SARS-CoV-2)以及甲型流感和乙型流感。此外，还通过识别SARS-CoV-2刺突基因中5个常见突变位点用来证明SNV鉴别探针的功能。

稳健探针的结果（见下表1）显示在所有11个阳性对照中，均检测到IPC和MS2(100%)。36份SARS-CoV-2样本全部被鉴定出来(100%)。其余的人类冠状病毒(229E、NL63、OC43和HKU1)以及SARS-CoV-1和MERS-CoV靶点的检出率也均为100%。

表2总结了36项试验中针对SARS-CoV-2变体的SNV特异性探针的性能。结果显示除了484E外，所有探针的灵敏度都至少为90%。484E探针性能不佳的部分原因是Delta变体的扩增子中存在SNV (T478K突变)。所有其他探针都显示出100%的特异性。

总之，这些数据证明了稳健探针和SNV鉴别探针串联工作的能力，可以快速识别存在的RNA靶标(使用稳健探针)，并提供单核苷酸分辨率(使用SNV鉴别探针)。

作者进行了一系列实验来确定RT-caPCR法的检出限。通过改变病毒RNA输入拷贝的数量和保持对照拷贝相同来量化检测的LOD。结果显示所有7种冠状病毒的LOD均为1,000分子。

作者通过模拟含有多个RNA靶标的共感染样本，探索了RT-caPCR在评估共感染样本的表现。每个模板的输入量为105个分子，直接加入RT-caPCR反应中，没有VTM提取步骤。作者单独评估了3种不同的病毒模板以及3种不同的组合:SARS-CoV-2 Delta变体+ HCoV229E(下图a)， SARS-CoV-2 Delta变体+ FluB Yamagata lineage(下图b)，以及SARS-CoV-2 + HCoV229E + FluB Yamagata lineage(下图c)。结果如预期：稳健(病毒鉴定)探针报告了包括所有病原体模板的存在，SNV鉴别探针正确地识别了Delta变体。这些数据证明了此技术能够准确评估含有多个感兴趣的RNA靶标的更复杂的样品，展示了该分析的多功能性。

这篇文章展示了对流阵列PCR (caPCR)技术在40分钟内从单个RNA样品中同时扩增和检测28个不同的RNA靶点。将可调节的链置换探针（strand displacement probes）整合到caPCR中，既可以只允许完全匹配，也可以允许多达2个单核苷酸变体的靶标进行RNA检测。作为概念验证，研究团队通过实验证明了在一次检测中可以检测到7种人类冠状病毒和7种SARS-CoV-2关注的关键变体。综上所述，此技术带来的临床敏感性的提高、周转时间的改善和多重检测能力的提高将导至对新出现的病原体菌株进行更彻底和有效的监测的临床影响。

本文提出的探针设计在稳健性和靶序列特异性方面的创新表明，RT-caPCR可以对呼吸道病毒诊断等应用的临床敏感性和流行病学追踪产生积极影响。然而，RT-caPCR的意义远远超出了诊断的范围:例如，作者预计这项技术将在RNAseq领域的转录组学等应用中发挥作用，因为它能够在保持单核苷酸分辨率的同时检查许多靶标。此外，可调探针设计可以作为caPCR平台上DNA检测的独立工具，用于研究应用，如系统发育跟踪。总之，该RT-caPCR分析的组成部分提供了传统RT-qPCR和RNAseq分析的可行未来替代方案，允许单核苷酸分辨率，改善周转时间，减少劳动力，具有广泛的预期实施范围。