【冯仁丰】C-反应蛋白的参考物质—ERM-DA472和ERM-DA474 1

一、建立ERM-DA470（CRM-470）参考物质

1993年，欧洲共同体参考局（European Community Bureau of Reference ，BCR）发布的参考物质CRM-470，是临床实验室检测各种血清（或血浆）蛋白（曾被称为特种蛋白）国际认可的参考物质。由于从设计、制备、和定值各个环节，都给与充分的研究和保证，这个参考物质从发布起，立即得到了全世界临床实验室的广泛认可。从此，全世界的体外诊断厂商的各种蛋白的检测系统，凡是在CRM-470参考物质中被确认的，均以CRM-470为准，校准它们的校准品定值。使全世界临床实验室对病人血清（或血浆）的这些蛋白检测结果，逐渐实现了良好的可比性。基本上满足了临床对病人疾病诊断和监视的要求。

二、2008年出现了ERM-DA470k/IFCC和ERM-DA472/IFCC

从2008年起，欧共体参考局将发布的参考物质重新命名为ERM（European Reference Material），强调是欧洲的参考物质。因此，原CRM470的参考物质，被更名为ERM470。并且完全按照参考局对所有参考物质分类编排，临床实验室专用的参考物质为DA类；而且非常强调，这个参考物质一直是在国际临床化学协会（IFCC）支持和配合下完成的，因此更改后的这个CRM 470的全称改为ERM-DA470/IFCC。

2008年，该参考物质即将用完，因此需要再制备一批。承担研究制备这个参考物质的是比利时海尔市（Geel）欧共体联合研究中心，参考物质和测量研究院（IRMM）。该中心的I.Zegers负责这项任务。工作组完全按照原ERM-DA470的制备方案，制备新一批的参考物质。制备完成的制品依然被称为ERM-DA470。

该参考物质也完全按照原先方案，将血清分装后进行冷冻干燥处理。

经检测发现，新一批的ERM-DA470内C-反应蛋白的实际含量，只是分装前液体物质内具有的CRP的约80%。出现了明显减少的偏移。

为此，经研究决定，将冷冻干燥的这个参考物质命名为ERM-DA470k/IFCC。对其中12个蛋白进行了定值。取代ERM-DA470。C-反应蛋白没有包括在这个参考物质内。

为了提供一个对CRP以后使用具有最佳条件的参考物质，将制备ERM-DA470k/IFCC的原液体物质（冷冻干燥前的液体血清），分装安瓿后封口后置深低温冰冻保存于-70℃，成为专门为CRP检测使用的参考物质，命名为ERM-DA472/IFCC。

ERM-DA472/IFCC使用了ERM-DA470参考物质为校准物为CRP定值。使用了目前认为是参考程序的值转移方案予以实现。用于测量（检测）CRP浓度的原理为免疫散射和免疫透射。在不同的仪器/试剂组合下（Abbott Architect、Beckman Immage、BN Ⅱ、不同的Hitachi仪器、和Olympus AU 640）进行测量。有8个实验室参加了定值。被确认的CRP质量浓度为41.8 mg/L，扩展的不确定度（k=2）为2.5 mg/L。

三、冷冻干燥造成CRP回收问题的表现和原因

造成ERM-DA470k/IFCC经冷冻干燥后，内含的CRP检测结果回收不佳（见图1）。

经研究确定是CRP在冷冻干燥过程中，是内含CRP产生了解离。原先具有生物活性的人CRP，在血浆中呈一个五聚体结构。（图2）

1、CRP的不同低聚物形式对检测结果的影响：

临床检验的免疫检测，检测的是目标蛋白与对应抗体间形成的凝聚物（是凝聚物使分析仪上入射光的散射或透射光强度变化，产生了检测信号的变化）。

但是，经诸如冷冻干燥处理中，使原先的蛋白分子被解离，加入的抗体与解离的抗原分子难以形成聚合物，产生不了可检测信号！

因此，从校准开始因低聚物状态而变化，严重影响了检测过程！最后变得无法检测。

上述解释也许是当前对采用抗原抗体反应，经冷冻干燥处理后产生严重后果的较好解释。

2、为什么ERM-DA470/IFCC没有报告冷冻干燥对CRP检测结果的影响？

很长时间里我也有想法，为什么第一批ERM-DA470/IFCC，也经历了冷冻干燥处理。应该也发生了上述的变化。但为什么没有报告反映，冷冻干燥对检测结果的影响进行分析研究？当时的CRM470研究中，应该也检测了回收率，怎么没有出现如ERM-DA470k/IFCC内，如此不佳的回收表现？

我再次查阅原CRM-470的资料，认真查对。发现当时在制备CRM-470 时，没有对用于制备参考物质的原始混合血清内含有的CRP，进行过检测！将外加的CRP混到血清中，也没有检测冷冻干燥前CRP的含量！只关注了冷冻干燥后经复溶液内被所有参与定值实验室，检测结果的一致性！这个漏洞大家都被疏忽了！

感谢IRMM参与制备ERM-DA470/IFCC的团队！他们确实非常认真地检查了整个制备全过程的内容！

如果，2008年的整个制备过程记录，也像1993年那样，忽略记录参考物质内含有的CRP含量的变化，那么也不会出现今天的ERM-DA470k/IFCC和ERM-DA472/IFCC两个参考物质了！感谢IRMM的团队！

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