IVD新技术丨多重POCT新技术应用

即使使用优化的抗体和缓冲液，LFA的分析灵敏度在很大程度上受到报告粒子的可检测性的限制。荧光报告，包括有机荧光基团，铕螯合物，上转换发光和量子点提供了更高的分析灵敏度，但需要复杂的检测光学器件，且不适合多路复用。通过酶或酶模拟物或核酸扩增进行信号放大可以增加LFA的灵敏度，但也不能方便复用，限制了它们的POC用途。此外，多重POC测定法的发展仍然具有挑战性。因此，尽管取得了多项进展，但仍然需要更灵敏、可复用的LFA技术，这些技术要易于使用、货架稳定性和阅读简单。

近日，来自休斯顿大学的研究团队在杂志Communications engineering上发表了一篇题为“Glowstick-inspired smartphone-readable reporters for sensitive, multiplexed lateral flow immunoassays”的文章。在这篇文章中，作者展示了基于荧光棒原理的发光LFAs，不需要光激发，使用低毒性和气味的化学试剂激发，并与硝化纤维素膜和常见的临床相关样品基质兼容。在概念验证实验中，在缓冲液中检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)，在鼻拭子提取物中检测SARS-CoV-2核蛋白，LOD分别为39 pg/mL和100 pg/mL。作者还演示了使用单一激发试剂和智能手机在单个LFA试纸条上对多种分析物进行彩色多路检测。

普通荧光棒的原理是：双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯TCPO和过氧化氢一起产生的化学能，让荧光染料在不需要光激发的情况下转变出可见光（下图）。为了证明使用过氧化草酸酯来化学激发荧光纳米颗粒的可行性，作者选择9,10-二苯基蒽作为LFAs中发光报告粒子进行概念验证。当使用智能手机相机成像时，单独的染料可以检测低至200 nM。

市售的0.2µm荧光聚苯乙烯ThermoFisher fluorospheres™微球具有不同的颜色，也可以通过TCPO和H2O2的1:1混合进行化学激发。使用化学激发和智能手机成像检测到约100,000个颗粒，灵敏度与使用酶标仪相当。对于红色和绿色颗粒，光信号的亮度至少在10分钟内是稳定的，对于蓝色颗粒，在5分钟内亮度下降了50-60%。

TCPO的溶剂通常是邻苯二甲酸二乙酯，与长期生殖毒性有关。为了减少用户暴露提高POC的可用性，作者筛选了TCPO溶剂和H2O2共溶剂，减少毒性和气味，最大限度地提高发光信号的强度和稳定性。经筛选，发光LFA的最佳TCPO溶液为15mM TCPO，溶解在33.3%的苯甲酸丁酯和66.6%的柠檬酸三丁酯。H2O2底物含有45 mL的叔丁醇，5 mL的30% H2O2和1 mM的四丁基硫酸氢铵基催化剂。这些优化使用低毒低气味的试剂，会产生稳定的信号和尖锐的LFA线，且会产生更持久的信号。

聚苯乙烯颗粒(蓝色;9,10-二苯基蒽)用小鼠抗β-hCG抗体功能化，并在硝酸纤维素抗hCG半条带上检测不同浓度的hCG时，将条带进行化学激发，使用三星Note 8智能手机相机成像，获得了39 pg/mL hCG的LoD， 即使在19.5 pg/mL时也能看到微弱的测试线(图b - d)，比使用标准40 nm金纳米颗粒和相同抗体制备的金LFA灵敏度高10倍(图b)。

为了评估化学激发发光与临床相关样品的兼容性，在各种生物基质的存在下，对蓝色ThermoFisher FluoSpheres进行化学激发，并用智能手机相机成像。25%人血清中的发光亮度为缓冲液中的95%，鼻拭子提取物为70%，25%唾液为88%，表明辉光化学与多种生物基质具有相容性。在100%血清中，颗粒无法通过条带迁移，无法产生可检测的测试线(TL)或对照线信号。在75%血清中，TL信号是缓冲液中荧光信号的70%。低LFA TL信号可能是由于基质干扰颗粒流和/或抗体结合。这可以通过进一步的血清稀释、缓冲液和样品制备优化和/或LFA材料优化来介导。

为了初步证明化学激发发光LFA在临床中的应用，作者开发了一种用于检测鼻拭子提取物中SARS-CoV-2核蛋白的发光LFA。重组SARS-CoV-2核蛋白稀释到COVID-19阴性的新鲜鼻拭子提取物中，在LFA试纸上运行，并进行化学激发。结果显示鼻拭子提取物中加入100 pg/mL的SARS-CoV-2核蛋白，很容易检测到(下图)。但需要进行LFA优化以减少非特异性结合。

蓝色、红色和绿色 ThermoFisher FluoSpheres发光颗粒用三种不同的检测抗体功能化，每种抗体针对单独的目标分析物。将所有三种颗粒混合在一起并添加到LFA运行缓冲液中，该缓冲液仅含有一种分析物或所有三种分析物的混合物(图a)。化学激发后并用三星Note 8智能手机相机成像。在单一分析物存在的情况下(图b)，测试线将显示为单一颜色，对照线将显示为混合颜色；在所有三种分析物存在的情况下，测试线也将显示为混合颜色。测试线信号可以通过标准RGB通道分离，以确定存在哪些分析物。

作者展示了一个使用荧光纳米粒子报告基团的LFA平台，其中光学激发被化学激发取代。荧光粒子的一步化学激发产生可见光可通过智能手机检测，提高灵敏度，同时保持简单和成本效益。此发光LFA检测常见模型分析物人绒毛膜促性腺激素，检测限(LoD)为39 pg/ ml，比使用相同抗体的标准金纳米颗粒灵敏度高10倍以上。还演示了该方法在鼻拭子提取物中检测100 pg/mL的SARS-CoV-2核蛋白的应用。多种荧光染料可以由一种试剂化学激发，允许在智能手机摄像头的单个LFA条带上进行多色复用。利用红色、绿色和蓝色荧光报告粒子在一条LFA检测线上检测三种分析物，使发光LFA成为一个有前途的多路检测平台。

目前使用的是密封在塑料滴管内的装有草酸盐和过氧化物的玻璃安瓿瓶，通过弯曲安瓿瓶(像荧光棒一样)来激活试剂，将滴管倒置几次以混合试剂，然后将混合物涂在LFA条上。研究团队的最终目标是将试剂存储在盒式内建的小泡中，并通过推动将其交付到LFA条带，限制用户暴露于试剂并简化分析工作流程。与其他高灵敏度LFA报告技术不同，发光LFA增加了分析物检测的灵敏度，同时又不影响简单性和POC适用性。