IVD技术 | 基因组整合位点分析工具 GENE-IS

周末和朋友聊到基因组整合位点分析，他想要寻找一种高效、准确、和可靠的工具来分析基因治疗数据中的病毒载体整合位点（ISs），监测基因修复细胞的命运，评估恶性转化的风险和建立载体生物安全性。我想到使用NGS应该可以分析不同类型的数据和载体系统，搜索论文发现在Molecular Therapy - Nucleic Acids杂志上的一篇文章中有一种名为“GENE-IS”的方法，文章作者Afzal等人介绍了一种基于下一代测序（NGS）的病毒整合位点分析工具，名为Genome Integration Site Analysis Pipeline（GENE-IS）。该工具具有双重分析模式，可以同时分析基于PCR方法（如LAM-PCR）和靶向测序技术（如Agilent SureSelect）产生的基因治疗数据。GENE-IS利用修剪策略、定制的参考基因组和软剪切信息，经过顺序过滤步骤，提供带有克隆性信息的注释IS。它是一种可扩展、稳健、精确和可靠的工具，适用于大规模的临床前和临床数据分析，为用户提供完全的灵活性和控制能力，具有广泛的可配置参数。不过该文章发表距今约7年，时效性较差，但作为一种开发思路有很好的参考价值。

GENE-IS由两个主要的分析模式组成，分别针对LAM-PCR和靶向测序IS分析。在LAM-PCR中，通常将多个样本混合在一起进行同时测序，以提高过程的时间和成本效率。GENE-IS首先对输入数据进行质量控制和修剪，并根据用户指定的参考基因组进行比对。然后，GENE-IS使用软剪切信息来识别可能的IS，并将其与已知的重复序列、假基因、线粒体DNA和核糖体DNA进行比较，以去除假阳性结果。最后，GENE-IS对每个IS进行注释，并计算其克隆频率。在靶向测序中，GENE-IS使用相同的质量控制、修剪和比对步骤，并利用双端读取信息来检测IS。GENE-IS还可以根据用户定义的区域或基因列表来过滤感兴趣的IS。

总结出GENE-IS的一些特点：

• GENE-IS是一种基于NGS的ISs分析工具，它可以同时分析PCR-based方法（如LAM-PCR）和快速发展的靶向测序（如Agilent SureSelect）技术产生的数据。

• GENE-IS利用修剪策略、定制化的参考基因组、和软剪切信息，通过顺序过滤步骤，提供带有克隆信息的注释IS。

• GENE-IS是一个可扩展、稳健、精确、和可靠的工具，适用于大规模的临床前和临床数据分析，提供用户完全的灵活性和控制性，有广泛的可配置参数。

• GENE-IS已经在不同类型的数据集上进行了测试和验证，包括人类、小鼠、狗、猴子等不同宿主基因组，以及不同类型的载体系统，如逆转录病毒（retrovirus）、逆转座子（transposon）、和CRISPR/Cas9等。GENE-IS与其他现有的工具相比，具有更高的时间效率、准确度、灵敏度、和特异性。

• GENE-IS是一个高效、灵活、和易于扩展的方案，用于分析不同实验方法（包括PCR和靶向测序方法）产生的大规模高通量测序数据。

以上内容如GENE-IS推广软文一样丝滑，不过也有一些缺点。

笔者认为文章提供了一种新颖且实用的工具，用于分析基因治疗数据中的病毒载体整合位点，有助于评估基因治疗的安全性和有效性；涵盖了LAM-PCR和靶向测序两种常用的实验方法，增加了工具的适用性和灵活性；在数据处理和结果呈现方面都表现出高效、准确和可靠的特点，并与现有的工具进行了比较和验证；还能够发现低频率或亚克隆水平上的整合位点，揭示出潜在的插入突变事件，为基因治疗的风险评估提供了重要信息。但文章并没有对不同类型的病毒载体或宿主基因组进行系统性的分析，可能存在一些特异性或偏差；也没有对整合位点的功能影响进行深入的探讨，例如整合位点是否会导至基因表达或调控的改变，是否会影响细胞增殖或分化等；同时也没有提供足够的实例或案例来展示工具的应用场景和价值，例如在临床前或临床试验中如何使用GENE-IS来监测基因修正细胞的命运和安全性等。

    原文GENE-IS: Time-Efficient and Accurate Analysis of Viral Integration Events in Large-Scale Gene Therapy Data DOI：10.1016/j.omtn.2016.12.001 PMCID：PMC5363413 PMID：28325279 GENE-IS可以在https://github.com/G100DKFZ/gene-is免费获取。

    除了GENE-IS之外，以下的工具也可以用于病毒载体整合位点分析：

• SeqMap：一个安全的、基于网络的载体整合位点管理工具，可以自动分析和注释来自LM-PCR实验的大量载体整合位点。支持逆转录病毒载体。在SeqMap的官方网站上注册一个账号，然后上传测序数据和病毒载体序列，选择合适的参数，然后等待分析结果。

• VSeq-Toolkit：一个综合的计算分析工具，用于病毒载体在基因治疗中的表征和分析，包括检测载体制备中的污染物、载体内部融合断点和载体与宿主融合事件。支持多种病毒载体，包括腺相关病毒（AAV）、逆转录病毒、腺病毒和肠道病毒。在GitHub上下载VSeq-Toolkit的源代码，然后在本地安装和运行。需要准备一个配置文件来指定您的输入文件、输出目录、参考基因组和病毒载体序列等信息。然后，您可以根据需求选择不同的分析模式。

• VISMapper：一个超快速的、穷举式的载体整合位点制图工具，利用Bowtie2或BWA-MEM进行高效的序列比对，并提供可视化和统计功能。支持逆转录病毒载体。在GitHub上下载VISMapper的源代码，然后在本地安装和运行。需要准备一个配置文件来指定您的输入文件、输出目录、参考基因组和病毒载体序列等信息。然后，可以运行VISMapper来进行比对、过滤和注释。

• Virus-Clip：一个快速和内存高效的载体整合位点检测工具，可以利用软剪切测序读取中提取的信息来确定人类和病毒断点的精确位置。支持人类免疫缺陷病毒（HIV）和鼠白血病病毒（MLV）等逆转录病毒载体。在GitHub上下载Virus-Clip的源代码，然后在本地安装和运行。需要提供一个BAM文件作为输入，以及一个包含病毒载体序列和人类基因组序列的FASTA文件作为参考。然后运行Virus-Clip来进行软剪切读取提取、比对和整合位点检测。

       根据2020年9月发布的《细胞治疗产品申请临床试验药学研究和申报资料的考虑要点》“生产工艺开发的技术要求”及“质量研究和质量控制中的安全性研究”部分要求提供目的基因在染色体中的整合情况及提供细胞恶性转化（成瘤性和致瘤性）进行安全性研究和评估内容。2020年2月发布的《免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）》中规定：探索性临床试验的安全性和耐受性要考虑"外源基因随机整合到细胞基因组形成插入突变，导至成瘤性和恶性转化等"。对确证性临床试验的疗效和安全性要求:“继续监测安全性风险，分析重要的已知和潜在的风险信息，包括迟发性不良事件(如致瘤性)的发生率、 严重性和危险因素等，并有必要采取措施使风险最小化。" 2021年2月发布的《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》明确将"插入突变风险评估"作为非临床安全性研究的内容，并详细规定关键风险因素的评估要点。关于非限制性线性扩增介导的 PCR (nrLAM-PCR) 和 LAM-PCR 扩增的载体 IS 进行测序可以参考论文The LAM-PCR Method to Sequence LV Integration Sites， DOI: 10.1007/978-1-4939-3753-0_9，希望以上内容对你有用，期待一起探讨。