取真经 | 敢问IVD不卷,路在何方？（下）

循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）泛指存在于外周血中的各类肿瘤细胞，CTCs被认为是一种来源于肿瘤原发灶或转移灶，在特定条件下释放进入外周血液循环的肿瘤细胞。大部分CTCs在进入外周血后会凋亡或被吞噬，少数CTCs能够逃逸并在组织中附着，发展形成转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。CTCs在肿瘤发生转移前即可出现，因此，其也被认为是一种转移的前体细胞，是肿瘤获得侵袭性能力的体现之一。

CTCs 检测技术主要由2个关键部分组成：CTCS分离富集技术和CTCs鉴定技术。理想的CTCs分离富集技术应能达到高灵敏度、高特异性、分离出的细胞具有完整生理性且能够实现在较短时间内处理大量样品的能力。

CTCs分离富集技术目前主要是基于物理特性和生物特性，前者取决于肿瘤细胞尺寸，密度等物理性质，后者依赖于抗原抗体结合反应。目前，基于物理特性的富集方法有基于密度梯度离心和膜过滤分离肿瘤细胞术等。密度梯度离心是根据肿瘤细胞与白细胞密度的差异来捕获靶细胞，而膜过滤是通过控制孔径大小来分离靶细胞，这种方法虽然操作简单但捕获细胞效率有限。基于生物特性的富集方法中的细胞搜索（Cell Search）系统即是一种基于上皮细胞黏附分子免疫检测的CTCs富集方法，它是美国食品药品监督管理局批准的第一款用于检测CTCs的产品，但该产品目前由于成本高昂且检测过程复杂，检测时间长，纯度不高等原因在临床检测中未被广泛应用。与细胞搜索系统原理类似，基于免疫亲和捕获的微流控芯片近年来也逐渐被开发并应用于临床。免疫亲和捕获法是将特异性抗原包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠，再与靶细胞上抗原结合形成“靶细胞-抗原抗体-磁珠”复合物，在磁场作用下向一定方向移动，从而富集靶细胞。这种方法的优势在于捕获的CTCs纯度较高且易于实现自动化分离富集程序。

CTCs鉴定技术目前最常用的是免疫荧光染色、反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-PCR，RT-PCR)等。免疫荧光染色是在富集CTCs后，用角蛋白荧光抗体、抗CD45和DAPI等荧光染料对细胞进行染色。其主要优点是在荧光显微镜下即可观察细胞蛋白表型及形态，但该方法不能很好地表征细胞状态。RT-PCR可通过检测外周血中特定的反转录DNA片段来间接检测CTCs。RT-PCR具有灵敏度高、无创、可重复性好等优点，但由于RT-PCR是在基因层面上鉴定CTCs，因此通过该方法鉴定的CTCs不能进行细胞变形性分析和药物反应监测等实验。此外，随着CTCs分析的不断深人，CTCs荧光原位杂交结合纳米过滤技术采用特制纳米膜在不依赖于CTCs标志物的情况下高效分离CTCs，能够实现CTCs分型分析。

CTCs 比正常血液细胞体积大，核质比高且细胞核不规则，细胞表面表达的生物标志物有一定差异，细胞内可携带有核酸、蛋白质等分子信息。CTCs检测作为一项液体活检技术，具有取样方便、侵入性小、表达信息较为完整、无放射性污染、成本低等优势，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效检测手段之一。大量研究表明，即使恶性肿瘤患者处于临床早期阶段，CTCs也存在于肿瘤患者的外周血中，这为早期发现肿瘤的复发转移，确定肿瘤分子特征，选择合适的个体化治疗方案及评估疗效等提供了重要的实验室依据。

CTCs作为一种无创的诊疗方法，展现了早于影像学方法来预警恶性肿瘤的潜能，通过结合其他肿瘤生物标志物将有助于监测肿瘤复发转移、判断患者预后。与肿瘤组织样本相比，血液样本更易获取、创伤性小、可反复采集，是临床上常规检测较为理想的标本来源，极大地提高了这一方法的应用价值。随着CTCs检测技术的不断发展，CTCs分析已在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中得到应用。

成熟度：***

外泌体（Exosome）是一类由各种活细胞通过内吞、融合、外排等一系列生物学机制产生，并通过主动分泌方式排出细胞膜外的脂质双分子层膜性囊泡，直径为30~150nm。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，在体内参与免疫应答、细胞迁移、细胞分化等过程，与多种疾病的发生和过程紧密相关。基于外泌体的检测是通过对外泌体的有效分离和内容物的精准分析，评估机体的病理生理状态，为疾病的诊断提供诊断依据。

外泌体主要负责细胞间的物质运输和信息传递，其结构较为稳定、包裹的内容物丰富，特别是含有大量的特异性细胞因子、功能性mRNA等生物信息，这些物质与多种疾病的发生发展密切关联。因此，通过针对不同疾病体液样本中外泌体的组学研究，如基因组学和蛋白组学等，获得外泌体及其内容物的分布情况，从而进一步筛选生物标志物应用于疾病的早期诊断。相较于CTC和ctDNA 2种标志物检测方式，外泌体检测具有样本形式丰富、样本获取方便、外泌体膜上及膜内含物更稳定的优势，因此开展基于外泌体的液体活检，有利于疾病的诊断和动态检测技术的开发。

外泌体检测作为一种液体活检的新型诊断方式，在我国恶性肿瘤发病率提升的大背景下需求攀升，市场规模不断扩大，随着技术的提升，行业得到快速发展。虽然外泌体的生物学功能尚不完全清楚，但其在体外诊断领域的技术开发和应用具有广阔的发展前景。

通过分离提取血液或者尿液中外泌体，与测序、质谱分析、荧光定量PCR、免疫组化、荧光原位杂交和生物芯片等技术的联用，开发外泌体相关新型标志物，为恶性肿瘤等疾病的早期诊断和治疗预后筛选新的高特异性生物标志物，以期应用于疾病的早期筛查和诊断。进一步针对性开发外泌体及内容物的定量检测技术能够更为精准反映疾病发生发展进程，为疾病诊断试剂的开发提供技术支撑，从而尽早地诊断和治疗恶性肿瘤。同时，开发基于外泌体快速分离检测和动态监测装置，能够为突发疾病的POCT即时检测诊断、迁延疾病的实时动态监测提供新思路。

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液相色谱-串联质谱技术（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）最早应用于科学研究，20世纪90年代产业化后，首先应用于药物研发，并随着技术的发展在2000年前后逐渐应用于小分子代谢产物等生物标志物的临床检验工作。在北美地区，临床质谱更多在第三方独立医学实验室及中心医疗机构中得到应用。而在国内，质谱技术最早应用于药物临床试验及新生儿遗传代谢病的筛查。2007年前后，国内部分独立医学实验室及一些三甲医院开始开展临床质谱检测项目。虽然中国与北美临床质谱起步时间接近，但由于国内缺少IVD注册的质谱设备、缺乏对LDT的政策支持、第三方独立实验室市场占比小、相关收费标准更新滞后、技术人员专业培训不足，且无可持续发展的商业模式等原因，质谱技术在中国临床实验室诊断中的应用发展缓慢。近几年，在行业各界专家的共同推动下，各个质谱厂商陆续向市场上推出一系列获得IVD注册的质谱仪器及试剂盒，液相色谱-串联质谱技术在中国临床领域的应用进入了快速发展时期。

化学发光法虽然可以实现快速和高通量，但是其特异性低，易与自身抗体、特异性抗体发生交叉反应，从而出现假阳性或假阴性；而且不同品牌试剂对目标化合物的捕获效率可能存在差异，不同平台的检测结果可比性差。而液相色谱-串联质谱技术以其样品量小，快速、高灵敏度、高特异性及可以同时检测多种化合物等优点作为小分子检测的“金标准”逐渐被临床检验的专家所关注。不同于生化免变方法主要依赖抗原抗体的反应，质谱是一种测量离子质荷比（m/z）的分析方法。基于分子结构本身分子离子化的过程来实现直接检测。因为液相质谱可以同时检测多个离子通道从而可以同时检测多个指标及其相关的上下游代谢通路，达到更精准高通量的诊断。人体中生物标志物浓度差异很大，如人体内激素类从pg/mL到μg/mL不同浓度，普通检测器很难同时满足对这几种化合物在线性范围进行的检测和对其高灵敏度的要求，而质谱的高灵敏度及6个数量级的线性范围可以一次进样同时检测低浓度到高浓度的多个指标。

近年来 LC-MS/MS技术凭借其高特异性、高灵敏度及可同时检测多个分析物、多维度疾病诊断的特点，在国际上被广泛应用于新生儿筛查、药物浓度监测、内分泌疾病、代谢慢病、蛋白标志物及急诊药物中毒筛查等400多项诊断项目中、国内已开展大约200项诊断指标的检测。

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拉曼光谱（Raman Spectroscopy）是一种散射光谱，它基于激发光与物质分子的非弹性相互作用产生。拉曼位移是分子的固有属性，可以特异性地识别物质的本征信息。

在微生物的体外诊断领域，拉曼光谱技术体现出特有的优势。

近年来，国内外研究者围绕拉曼光谱技术在病原微生物诊断领域的应用取得了大量的突破和进展。由于拉曼光谱信息包含了微生物的特征指纹，因此可用于微生物的分类和鉴定。

随着高端共焦显微拉曼光谱设备国产化率、性能和智能化水平的提高，微生物标本拉曼光谱分析流程规范化，以及病原微生物物种的标准数据库的建立，广泛应用于微生物临床检测的快速、灵敏、自动化、智能化的拉曼检测技术将为临床感染领域带来变革式的进步。

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太赫兹（Tera Hertz，THz）是频率单位之一，即10E12Hz。太赫兹科学（或太赫兹技术）通常指频段在0.1THz~10 THz的电磁波相关技术，包括传统的远红外技术和近年的太赫兹技术。太赫兹频段的电磁波处于光电过渡区，具有光电二象性，即仅有部分光学特性和电磁波特性可适用，导至大量成熟的光电技术无法适用于太赫兹波，这是目前太赫兹技术的瓶颈。

利用太赫兹波优于红外线的穿透性和优于无线电波的成像清晰度，诞生较为成熟的太赫兹远场成像技术，也就是传统的远红外技术，使用0.1THz~0.5 THz的太赫兹波。但在生物医学领域，太赫兹波受到大量生物大分子的吸收和谐振影响，目前可靠的人体组织成像穿透深度不足100 μm，清晰度约为1mm。其优势体现在一是可以通过不同组织对太赫兹波吸收度差异区分正常组织与肿瘤组织。二是太赫兹波能量远低于X射线，有安全性和无创性优势。

近年的太赫兹近场成像技术，基于生物大分子的自振频率都处于太赫兹频段的特性，通过采集太赫兹波的谐振波谱可以获得丰富的生物信息，是太赫兹波的独有特征。鉴于采集和信号分析对于样本要求高、难度大，目前生物大分子的太赫兹波谱信息库尚存在较大空缺，是目前太赫兹近场检测的核心问题之一。

太赫兹远场成像，虽然在安检等领域应用成熟，但是在生物医学领域的应用，仍以浅表肿瘤扫描为主，如皮肤癌检查、肿瘤边界扫描等。目前，以设备轻便化和小型化，以求应用于更多的无创检查和手术判查中，用于组织扫描。

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流式细胞技术是对单细胞进行定量分析和分选的技术，将样本在毛细管中形成单细胞液滴，再利用抗体和荧光对细胞进行分析和分选。现在的流式细胞技术已发展出成熟的四通道、八通道荧光分析，足以识别和分选各类细胞亚群，并且细胞功能评价更为精确。

多光谱流式细胞技术在细胞定量分析技术中具备最高效、高精度、高通量的优点。随着磁珠、脂粒、乳胶微球等辅助固定剂的发展，配合多样化精细化的抗体和荧光标记，流式细胞技术可以定性和定量的范围越来越广。从细胞膜上受体、胞核抗原、细胞骨架成分，到外泌体、亚细胞结构、突触小体等，均有成熟的抗体标记使用。

临床上利用流式细胞技术，标记免疫标志或肿瘤抗原，对临床样本的免疫细胞、肿瘤细胞筛选和定量，尤其是发现和鉴定样本中稀少细胞（如血液样本中的循环肿瘤细胞等）有极高灵敏度。此外，流式细胞技术能够在活细胞水平清晰明确地定性和定量，分选后活细胞可以培养后用于其他检测。

流式细胞技术目前广泛应用于免疫细胞和肿瘤细胞鉴定，尤其是在肿瘤微环境分析和循环肿瘤细胞分选鉴定中有着无可替代的地位。例如，肿瘤组织中分析和分选非转移性肿瘤细胞、转移性肿瘤细胞（CSV+EpCAM+）、肿瘤干细胞（CD133+CD44+）等并进一步进行突变靶标筛查和药物筛选。又如，免疫治疗中常用流式细胞技术分选出特定的T细胞（CD3+CD4-CD8+），通过基因工程技术改造后回输治疗。目前，有临床尝试应用于神经疾病，如脑脊液细胞分离鉴定等，对神经系统疾病辅助诊断和评估。在愈发强调个性化诊治的现在，流式细胞技术的精确定性定量分析，是非常重要的个性化诊疗一体技术，也是非常受瞩目的发展趋势。

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利用激发荧光来定性定量分析特定分子的技术在体外诊断领域已经有很长的历史，但是新的荧光技术不断涌现。技术发展包括多方面，检测方式改变如生物膜层干涉技术，染色方式改变如聚集诱导发光荧光探针，荧光染料改变如量子点染料等。

生物膜层干涉（Biolayer Interferometry，BLI）技术是检测干涉光谱的位移变化来检测传感器表面反应的技术，传感器末端光学膜层上由于分子结合或解离形成的膜厚度和密度变化，通过干涉光谱位移值实时监测。聚集诱导发光(Aggregation- Induced Emission，AIE）荧光探针技术是特定条件下，如部分基团与细胞膜表面精定成分结合，抑制探针分子的大共轭平面的旋转，从而减少了其他途径的能量损耗，使探针分子能量以荧光的形式呈现出来。量子点免疫荧光组织化学（Quantum Dots based Immunohistochemistry，QD-IHC）是利用量子点（或称纳米晶）维度在100 nm以下会产生明显的量子局限效应即量子阱，利用其不连续电子能级结构可被激发产生荧光，作为荧光标记特异性抗体，检测组织或细胞中抗原性物质的一种技术。

生物膜层干涉技术能够快速、准确、高通量检测特定生物分子，同时可以无损害回收样本，是非常理想的定量分析技术。检测基于分子互作结合，通过抗原抗体反应或蛋白分子结合，可检测多种生物样本，如蛋白、核酸、病毒、细菌等，应用场景广泛。

AIE 荧光探针具有典型的聚集发光效应，荧光强度和浓度呈正相关，通常具有较宽的吸收光谱，光敏性较强，可以与多种生物分子共孵育且不改变荧光背景信号等优势。常见的AIE类型非常多样，常见的如pH响应型硫化物、手性AIE铜簇分子、四苯基乙基（TPE）行生物、AIE-DNA四聚体等，可对pH、温度、溶剂、压力等不同刺激响应。

量子点的物理尺寸和激发荧光存在直接相关性，由于不涉及共轭双键系统，荧光亮度高且持久，可用于长时程活细胞观察。量子点激发光谱宽，可用同一光源激发多种量子点探针，同时量子点发射谱窄，现有成品探针四色检测可做到光谱无重叠。量子点半导体包括碳晶体、硅晶体、镉硒合金、镉碲合金等，再在表面修饰负电荷基团如硫化锌形成外壳，改善光学性质并具有良好的水溶性。

生物膜层干涉技术以其高通量特性主要用于病毒抗体筛选，如新冠肺炎病毒或禽流感病毒高亲和力抗体筛选。此外，测量分子间亲和力，应用于肿瘤抗体和补体检测、药物靶向性优化等。生物膜干涉技术特征显著，应用前景明确。

利用AIE荧光探针的环境敏感性响应特征检测特定微环境是其重要应用场景,常见应用包括革兰阳性菌检测鉴定、肿瘤浸润区域快速检查、AD快速早期诊断等。虽然 AIE荧光探针有较多优势，但是特异性问题在很大程度上限制了其应用空间,不断出现的各种改良尝试扩大可行范围以提高应用前景。

量子点优势明显，可以替代大部分传统荧光染料连接在二抗或生物素上，在组织化学和细胞学观察上应用广泛。临床上将量子点探针用于肿瘤示踪、神经疾病诊断等，科研应用更为广泛，发展潜力巨大。

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基因组学是通过高通量测序和生物信息学对机体所有基因进行集体表征和定量研究，包含基因组的结构、定位、功能、表达调控机制及进化规律等。随着2000年人类基因组工作草图的绘制完成，基因组学技术成为生物医学领域研究的最重要]具之一。目前，得益于基因组学技术的不断发展，其在遗传性疾病检测、无创DNA产前检测及肿瘤个体化治疗基因检测等方面已得到广泛应用，对于精准医疗的发展具有重要的支撑作用。

基因测序技术的发展主要是基因检测效率、通量和成本的变革，可以分为3个阶段。第一阶段为Sanger 测序法，具有检测长度长及高准确性的优势，但测序通量低、耗时长、成本高，因此应用范围有限。第二阶段主要是高通量测序技术，又称二代测序或下一代测序技术，其检测通量高、读长短，大幅降低了测序成本和时间，同时保持了较高的准确性，是目前主流的基因测序技术。第三阶段为单分子测序，主要包括单分子实时测序和纳米孔直接读取测序等，这是未来研究和临床应用发展的主要方向。

单分子实时测序的典型代表为Helicos Biosciences 和PacBio平台技术。其中 PacBio 是主流平台技术，其核心是边合成边测序的测序技术。单分子测序技术最大的特征是单分子测序和超长的测序长度，避免了PCR扩增引人的偏好性和突变.可以测到二代测序难以完成的重复序列区域和长结构区域，与二代测序形成结合互补。但该技术平台主要的缺点是单条序列错误率较高，以及测序成本较高等。

纳米孔直接读取测序的核心是通过电场力驱动单链核酸分子穿过纳米尺寸的孔道进行测序。其主要特征为超长读长，测序测定的是天然碱基，无须进行酶反应，在现有测序平台中能实现最长的读长；且测序速度快、测序仪器小巧便携、能直接测序RNA分子和修饰。但基于此，其准确度目前仍然低于其他平台，应用领域拓展还不完全，测序成本较高。若能解决测序通量、质量和成本问题，才能实现大规模应用。

目前，二代测序已经应用于临床许多领域，如非侵入性产前检查（Non-Invasive Prenatal Test，NIPT）、遗传性致病突变筛查、感染性疾病病原体鉴定、肿瘤用药指导等。三代测序的应用尚处于起步阶段，单分子实时测序技术主要应用在基因组组装和结构变异的发现，如肿瘤、遗传病和罕见病的结构变异分析；提升特定区域的测序质量和基因注释；DNA甲基化分析等。纳米孔测序技术主要应用在对满足现场检查和读长有需求的病原体的鉴定及抗生素耐药检测、表观基因组修饰的测序、直接RNA及修饰的测定、长的结构变异疾病的监测等。

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蛋白质组学（Proteomics）是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质表达水平、翻译后修饰、转录调控蛋白及其相互作用蛋白之间的联系等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。自2014年起，凭借高分辨生物质谱的优异性能，对大量生物样本的整体蛋白质表达谱、修饰谱等进行定性和定量分析，首次构建了人类蛋白质草图，成为蛋白质组学领域的一个里程碑。

蛋白质组学研究在其细分领域有着不同维度的优势。其中，全蛋白质组学可根据蛋白质种类、数量、局部存在的时间、空间上的变化来研究表达于细胞、组织及个体中的全部蛋白质，并从其结构和功能的角度应用各种技术手段综合分析生命活动。磷酸化蛋白质组学研究蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程，几乎调节着包括细胞信号转导、细胞分化、细胞生长、细胞骨架调控、细胞调亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢等生命活动的所有过程。因此，有助于揭示肿瘤发生发展信号转导规律和分子机制的整体探索，也在大规模、系统筛选以磷酸化改变为特征的肿瘤分子标志物上显示出独特的优势。转录因子蛋白质组学则是研究转录因子与DNA结合后，在各类生理和病理条件下，DNA修饰及开放区域发生的动态变化，该项研究对细胞生长、分化、代谢、周期调控和细胞调亡等生物学过程有着重要作用。

全蛋白质组学应用：全蛋白质组学作为连接基因组与临床应用之间的桥梁，为从整体水平研究临床疾病开辟了更广阔的前景。通过全蛋白质组学技术，分析相关疾病患者的体液，建立完整的蛋白质数据库，结合各种生理病理过程，利用与疾病相关的多种生物学标志物，有助于各种疾病的早期发现和治疗。

磷酸化蛋白质组学应用：对疾病发病机制、诊断、生理功能及药物的开发进行整体化系统性的分析，并从中寻找线索、推断可能的病因及诊断靶标；一些新的或可疑的差异磷酸化蛋白质分子一旦经过验证即有望成为肿瘤诊断标志物。

转录因子蛋白质组学应用：尤其在疾病研究中，特定种类的转录因子活性异常与发育失调、炎症和癌症等疾病相关，转录因子可以在分子层面对疾病进行分型，有望成为相关疾病治疗的潜在靶标，以起到对个性化精准治疗研究的积极推进作用。

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基质辅助激光解吸电离飞行时间核酸质谱（MALDI-TOF MS）是一款高精确度、高灵敏度，高样本通量的核酸检测仪，通过对待测样品进行激光解吸电离，并根据质量-电荷比（m/z）分离、检测不同质量的离子，得到精确分析的结果。

飞行时间核酸质谱技术可实现单孔最多60重基因位点同时检测且无须荧光标记.检测下限可达0.1%低频突变；仅需微量样品（推荐10ng/反应），检测下限可低至0Am，兼容各类样本类型，从DNA到结果输出仅需6～8小时，每天能完成300例样本检测；全自动分析结果，不受人为因素干扰，单样本检测试剂成本相对较低。

核酸质谱在多基因多位点检测方向具有高特异性、高灵敏度、高时效性、高样本通量、高灵活性，低检测成本、低核酸起始需求、低操作难度的特点，是检测几十到几百个基因性价比最高的中通量基因检测设备。该平台整合了PCR技术的高灵敏度、芯片技术的高通量、质谱技术的高精确度和计算机智能分析的强大功能，为市场提供了一个具有显著成本优势，简易工作流程和高通量的全自动解决方案，是目前兼具“多、快、好、省、灵活”五大特点，非常符合在医院内开展多基因多位点临床检测的平台。

飞行时间核酸质谱作为国际公认SNP、DNA甲基化分析的黄金标准，特别适合于从疾病发现到大样本 Biomarkers验证以及商品化试剂盒转化，其应用范围覆盖生物学的各个领域，慢病精准用药、感染精准防控、肿瘤精准治疗、遗传病精准筛查和临床转化医学研究等。

代谢组学（Metabolomics）研究的是基因组学和蛋白质组学下游的生物体整体代谢物的变化。通过对人体内全部的小分子代谢物的测定来分析代谢改变与人体生理病理变化的关系，反映了在生命体中已经发生的过程，因此能够更准确提供生物学的终端信息。临床代谢组学，是指结合临床大样本，采用代谢组学和生物信息学等手段，从整体上描绘内源性代谢小分子集合在疾病扰动下的稳态失衡及药物干预下的转归机制，揭示疾病潜在的诊疗生物标志物和研究可干预的靶标。随着国内外大型队列的健康人群和疾病人群代谢谱图库的建立和对比分析，代谢组学将极大完善现有的临床诊疗格局。

级联放大功能：基因和蛋白表达的细微变化可通过功能代谢酶的催化反应在代谢物上得以放大，从而使检测和分析更加容易。

代谢物的表达调控除了受自身遗传因素（基因）决定外，还受到环境因素、肠道菌群的影响，具有更强的动态性，能够更加直观、灵敏地反映生物体变化。

代谢反应及其终产物在各个物种的生物体系中都是类似的，因此，代谢组学方法学通用性更强（不需要建立单独物种数据库）。

代谢组学的技术不依赖于全基因组测序及大量表达序列数据库，直接对几乎所有样本类型进行检测。目前最常用的LC-MS 技术具有广泛的代谢物种类覆盖和良好的灵敏度，可检测的常见代谢物种类包括脂类、氨基酸类、核酸类、碳水化合物类、有机酸类、维生素和外源代谢物等。

代谢组学在临床诊断上被认为有广阔的发展前景，主要应用在临床诊断标志物发现方面的探索、病因病理机制研究中的应用、临床用药指导及治疗干预后恢复评估等。

临床诊断生物标志物的发现：代谢组学使用的质谱主要有两类，一类是高分辨质谱，用于“全景式”研究非靶向代谢谱，主要用于科研“发现”；另一类是三重四极杆质谱，主要用于精准定量，应用于临床代谢指标的检测。上述两类质谱可配合使用，实现从发现到验证的代谢组学研究。

病因与病理机制的研究：人体内的许多内源性小分子代谢物的水平高低在一定程度上反映了其生化代谢的机能和状态，因而通过代谢组学分析寻找特定疾病引起的代谢通路失调，从发现的代谢物异常处入手助力探索和揭示疾病起因、发病机制，以及新的治疗手段等。

临床生物标志物的应用：目前已进入临床应用的标志物如，葡萄糖、胆固醇、同型半胱氨酸，激素、维生素D、肌酐、尿酸等均为代谢物。而基于多组学的组合标志物是目前生物标志物研究重要特征趋势，同时采用大分子蛋白质和小分子代谢物组合，会显著提升疾病诊断或评价药物治疗有效性的灵敏度和特异性。

临床用药指导和预后评估的应用：药物的安全使用需要考虑剂量、剂型、用药方法与时间、药物不良反应等，多种药物联合使用还涉及复杂的相互作用风险，因此用药指导在临床治疗中有很重要的意义。相对于指导用药的基因型研究和常规检测，代谢组学可以更准确地监测患者用药后体内整个代谢网络的变化，为医生提供更精细的由药物引起的体内代谢变化状态，为药物治疗监控、药效评价、药物不良反应评估、手术与预后评价、个体化治疗方案定制等提供评判依据。

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DNA甲基化是表观遗传学研究的重要组成部分。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。DNA甲基化的研究对于深入理解基因表达、个体发育，以及疾病的发生、发展机制都具有重要意义，是近年来备受关注的热点之一。甲基化修饰方式多种多样，在真核生物中DNA甲基化主要发生于CpG岛的5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNA甲基化测序方法通常需要对待测DNA进行化学或酶学处理以分析DNA的甲基化位点修饰，但近年来，三代测序技术方法也可以直接对甲基化修饰进行测序。

DNA甲基化测序目前已经发展了10余种方法，其中3种最常用的方法是：全基因组甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS)、简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing，RRBS)、甲基化DNA免疫共沉淀测序(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing, MeDIP-Seq)。

全基因组甲基化测序是通过对全基因组DNA进行重亚硫酸盐（Bisulfite）处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成碱基，而甲基化修饰C碱基将保持不变，从而可识别发生甲基化的CpG位点。该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱，但测序费用相对较高。

简化甲基化测序是在Bisulfite处理前，使用MspI酶切对样本进行处理，去除低CG含量DNA片段，从而使用较小的数据量富集到尽可能多地包含CpG位点的DNA片段。相比于全基因组甲基化测序技术，简化甲基化测序是一种准确、高效目经济的DNA甲基化研究方法，该方法在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

甲基化DNA免疫共沉淀测序是一种采用抗体或甲基化DNA结合蛋白来捕获富集甲基化DNA的技术，这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域，如CpG岛，但不能进行单个碱基水平的分析。与简化甲基化测序相似，适用于大样本量的甲基化研究；但不同的是，甲基化DNA免疫共沉淀测序检测的甲基化图谱不能精确到单个碱基位点。

从技术角度，基于三代测序的甲基化直接测定技术、甲基化测序技术向单细胞领域的拓展，以及多组学数据联合分析与挖掘都特别值得关注；从临床应用角度,DNA甲基化信号是良好的肿瘤标志物，近年来甲基化测序被越来越多地应用到包括肿瘤早筛、分诊、治疗选择、微小残留监测、复发检测等临床领域中。

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数字化分析是将样品分成许多独立单元，每个单元包含不连续数目（0，1，2，3，）的靶标，通过泊松分布统计分析可以实现单分子/单细胞的精准定量分析。数字化PCR技术（dPCR）作为第三代PCR核酸分析方法，以其绝对定量、高灵敏度、抑制剂耐受的优势，正逐渐在临床分子诊断领域崭露头角。

dPCR检测包含样品分割、核酸扩增、信号检测与分析3个方面。样品分割是dPCR的关键，根据样品分割原理可将dPCR分为芯片式(Chip-based）和液滴式（Droplet)。液滴式dPCR一般通过微流控油包水的形式实现，优势在于宽动态范围（液滴数量多），缺点是液滴稳定性差导至检测准确性受限；芯片式dPCR通过微孔/微腔芯片实现样品物理隔离，检测重现性和稳定性高。dPCR的核酸扩增与传统PCR相似，根据检测芯片的结构选择与之适配的温控模块即可实现核酸扩增。dPCR的信号检测仪器主要有扫描式和成像式。扫描式检测逐个对液滴进行检测分析，主要用于液滴式PCR；成像式检测通过荧光激发与面阵探测器获取所有反应单元的信号，相比于扫描式检测具有效率高、适应性广、成本低的优势。虽然dPCR相比于qPCR具有绝对定量、高灵敏度、高特异性的优势，但是dPCR的临床推广应用尚需技术的迭代完善：

dPCR的应用主要体现在：

数字微流控技术（Digital Microfluidics，DMF）是一种新兴的基于介电润湿原理对微电极阵列上的离散液滴进行精准控制的全范围液滴操控技术。其包含两种实验技术，一种是微流控通道液滴技术；另一种是微流控数字液滴技术。微流控通道液滴技术是一种在微通道内对微流体进行编辑和检测的实验技术，可将环境监测等领域中所需要的反应步骤集中在一块非常微小的芯片上，通过通道和电场对液滴进行分选和捕获，可以产生粒径微小且均一的液滴，快速进行检测，具有可以精确进行样本的控制、仅需要少量的试剂、优良的生物相容性、极高反应效率、极低生产成本，以及可以实现自动化等特点，已经广泛应用于基因组的测序、核酸的检测、药物合成与筛选、各类疾病的诊断等领域。微流控数字液滴技术的特征是利用电场来操纵涂有介电材料的电极阵列上的液滴，介电层上方通常涂有疏水性材料，当向电极施加电势时，电荷会在芯片表面与周围介质之间的界面处积聚，这些累积的电荷产生的静电力有助于液滴向激活的电极移动。在微流控数字液滴芯片上的基本的流体操作是控制单个液滴的生成、液滴运输、分配和混合，可以自动进行样品处理，而不需要管或通道。简言之，通过向芯片极板电极上施加电压来改变芯片介质层与其上液滴的固液表面张力，进而控制单个或多组离散液滴的产生、分裂与转移等操作（图4-9）。

图4-9数字微流控平台示意

核酸检测与定量：从组织或细胞中提取的核酸是极少量的，传统离心管操作由于黏附作用不仅会造成核酸损失、分析困难，且极易产生气溶胶污染。DMF不仅具有强大的微量液滴操控能力，而且具有良好封闭性和低黏附的优势，尤其适合核酸检测等痕量或易污染样品的制备和分析。

成熟度：***

等温扩增是指在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物使核酸快速扩增的技术。等温扩增技术对仪器要求简单，在保证较高的灵敏度和特异性基础上，对样品中抑制剂的抗性也较强，扩增时间短，便于实现现场实时监控，非常适用于现场快速检测。但是当前等温扩增技术在灵敏度、特异性和抗干扰度方面仍有明显的不足。

目前，国内外开发很多新型技术和等温扩增技术联用，如CRISPR检测技术，信号放大技术、纳米增强技术等。其中CRISPR检测技术和等温扩增技术联用备受关注，被《科学》誉为下一代分子诊断技术。

CRISPR/Cas以在基因编辑领域的应用而出名，在这个过程中，Cas9蛋白与CrRNA二元复合物在识别外源靶标核酸后，Cas效应蛋白通过发挥核酸酶功能将外源靶标核酸进行剪切。近年来，研究发现Cas12a、Cas13a、Cas14a等效应蛋白与CRNA形成的二元复合物与靶标核酸特异性结合后，除了特异性切割靶标核酸外，还具有强大的附带剪切活性，可不加区分地切割其附近的dsDNA、ssDNA或ssRNA序列（图4-10)，实现10倍以上的信号放大。这类Cas效应蛋白的附带剪切活性可应用于对核酸的分子诊断，实现高灵敏、高特异性和低成本的分子检测。

图4-10 CRISPR/Cas分子诊断技术原理示意

2017年，美国麻省理工学院张锋教授团队率先在《科学》发表论文，第一次系统介绍了CRISPR/Cas作为分子诊断技术的应用，该方法将恒温扩增技术RPA和Cas13a系统结合起来，实现了对病原体高特异性、高灵敏度的检测，命名为Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing (SHERLOCK)，其检测灵敏度达到了attomolar 级，能够识别单个碱基差异。2018年，该团队对SHERLOCK进行改进升级，将CRISPR/Cas检测技术与侧向层析相结合，通过肉眼可见的显**况来判读结果，实现了该方法的多重化、定量化和可视化，命名为SHERLOCK V2。2018年4月，该团队继续在《科学》发表论文，对SHERLOCK的前处理方法进行改良，发明了Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases（HUDSON），该方法不经核酸提取纯化，仅需对临床样本进行核酸酶灭活和加热等快速处理，即可用于后续 SHERLOCK反应，利用HUDSON+SHERLOCK技术，在2小时内便可肉眼观测到寨卡病毒和登革热病毒的检测及分型结果。

同时，2018年，美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna 团队发现Cas12a被激活后可非特异性地剪切、降解单链DNA，并以此建立了另一个CRISPR/Cas分子诊断技术，命名为DNA Endonuclease-targeted CRISPR Trans Reporter(DETECTR)。DETECTR被用于HPV病毒的快速检测，灵敏度达到了attomolar水平，特异性为≤7个碱基。由于Cas12a-crRNA能够识别单链或双链DNA，DETECTR不需要将底物转换成RNA，省去了反转录步骤，因此，与SHERLOCK相比,DETECTR的操作更加简便。2018年10月，该团队在《科学》发表论文，报道了另一个新的Cas蛋白——Cas14，该蛋白分子量更小，识别的靶标为单链DNA,激活后除了剪切靶ssDNA外，还非特异性地剪切其他ssDNA，而且该蛋白不受PAM序列的限制，对靶ssDNA的特异性识别能力更强，由此开发出的CasI4-DETECTR可用于SNP检测。

美国麻省理工学院张锋团队开发的基因编辑IVD产品在2020年获得美国FDA紧急使用授权。在中国，杭州众测（CRISPR免疫层析法)和上海伯杰（恒温CRISPR法)也先后在2020年和2021年获得NMPA注册证。总之，CRISPR应用到IVD是一个划时代的发现，截至2021年，Cas12、Cas13及Cas14，都将等温扩增技术的检测提升到了更灵敏、更特异、更高效、更便捷的水平。因此，等温扩增技术与基因编辑技术的结合在未来能够被更加广泛地应用于病原微生物的快速检测、SNP检测、肿瘤筛选、抗生素抗性筛选等领域中，发挥核酸等温扩增技术最大的优势。

成熟度：*

人工智能医学与智慧大数据产业是人工智能技术应用的一个分支领域，在机器学习、神经网络、智能影像识别及精密控制方面有了飞速发展，结合疾病发生发展的高通量、多维度组学数据，包括基因组、转录组、表观遗传组、蛋白组和代谢组等生物信息，揭示诱发疾病危险因素和找到反映疾病发展不同阶段的特异性生物标志物，能够全面解析疾病的发生发展过程，最终实现疾病的精准评估、预测和干预。新一代的体外诊断技术以疾病的特征性标志物为依托，以医学大数据和生物医学大数据为工具，采用机器学习、生物信息挖掘等方式进行人群的疾病风险建模、评估和预测，并通过人工智能技术，为疾病的诊断和个人全生命周期动态监测提供精准的健康服务。人工智能与智慧大数据研究以人工智能装备研发、智能辅助诊断技术开发、智慧预警系统平台搭建为主流发展方向，从而服务于疾病早期诊断和治疗监控。

人工智能装备指可直接穿在身上、整合到衣服或用品上，甚至附着或植入人体.通过以硬件为基础的数据交互、以软件为支持的人工智能、以云端交互来实现强大功能的智能装备。随着人工智能技术的融入，其智能移动性及人机交互性显著改善了目前传统体外诊断领域存在的操作复杂、人员要求高等缺陷。人工智能设备可有效采集数据，并最终传输到移动终端和网络云端，再加上无线通信技术的多样化发展使得智能装备更具智能性和移动性。

近年来，人工智能在大型一体化设备及可穿戴装备领域发展迅速，各大公司已研发了系列高度集成的人工智能装备（图4-12)。例如，全自动核酸测序仪只需将样本放入仪器即可自动完成检测及数据分析；可穿戴连续血糖监测设备可实时监测用户皮下组织液的血糖及变异程度，通过人工智能分析，提供胰岛素注射剂量、系统参数自适应调整和预测血糖水平等功能；系列人工智能手表可通过在线软件实现心电图、脉率、心电血压等指标的监测功能。随着人工智能算法、生物传感器、智能芯片三大核心技术实现跨越式升级，人工智能在体外诊断领域的应用正逐步迈入2.0时代，监测系统更具规模，产品与应用软件间的交互、融合也变得更为丰富，基于人工智能装备的智慧医疗已逐渐成为未来的主要发展方向。

成熟度：*

医疗任务的复杂化极大地限制了人工诊断技术的发展，智能辅助诊断系统应运而生。智能辅助诊断是指使用人工智能技术为医生进行辅助的医疗诊断，主要包括相关疾病信息的获取、各种假设的推理及最终治疗方案的选择。自20世纪50年代以来，基于人工智能的辅助诊断系统逐渐应用于医疗诊断中，贝叶斯网络首次用Pearl的形式在计算机上进行医学处理，极大地促进了人工智能诊断的发展（图4-13)。

图4-13人工智能诊断系统用于X-Ray胸片、CT影像结果的识别

智能影像诊断是人工智能在体外诊断领域中应用较热门的场景之一。一方面，经过图像识别技术对医学图像进行辨认和剖析，快速发现病灶，并将其与正常组织细胞分开，提高影像诊断效率；另一方面，构建深度学习模型，通过对大量的图像和诊断信息进行深入挖掘且不断训练优化，提高模型的诊断能力，可显著降低对复杂疾病的误诊率。然而，语音识别和语义理解相比影像诊断发展略微缓慢，归因于其技术的复杂性及数据结构多样性。因此，继续开发新算法成为未来智能辅助诊断系统的主要发展方向之一，以实现对不同语言进行识别与解读。

成熟度：*

智慧预警系统是基于疾病防控的实时捕获和数据智能化分析，通过多防控、监测信息系统无缝连接，开发重大疾病监控预警分析系统，针对疾病发展趋势，尤其是危害公共安全的传染性事件，确定公共卫生突发事件，从而指导疾病的预防和控制的交互操作信息系统（图4-14）。

图4-14 深度学习算法训练预警分类模型

智慧预警系统开发过程中会引入多种医学理念，推动新兴生物技术、生物化学为主导的新技术、多学科交叉融合，以多因素介导下的疾病-防治互作的视角研究疾病指纹图谱、检测新技术、疾病发生机理与通路途径的调控机制，为实现精准疾病防控提供坚实的基础。通过提高特征性标志物图谱筛选效能和特异性标志物检测准确性，全面、深入挖掘不同来源临床数据信息，实现疾病动态评估、监测预警.跟踪随访、干预指导，提高疾病防控的可及性、精准化和智能化，为实现健康中国行动目标提供有力保证。因此，该领域研究和智能系统的开发对驱动该领域的前沿基础、应用基础与体外诊断产业技术系统研究与科技成果转化非常重要，具有十分广阔的应用前景。

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