肿瘤二代测序临床报告解读共识（2022.11）

随着肿瘤精准治疗时代的到来, 常规的病理学诊断方法已无法满足临床需求, 国内外多项指南和共识均认可基于二代测序（next generation sequencing, NGS）全面分子检测对于指导临床治疗的价值, 全面而准确的肿瘤基因诊断结果已成为临床诊疗的刚需。基于此, 为进一步提升临床医生NGS报告解读能力, 二代测序临床报告解读专家组在学习全球最新科研成果的基础上, 参考国际指南和中国国情, 经多学科专家组的反复讨论撰写了《二代测序临床报告解读指引》。此次二代测序临床报告解读肿瘤学专家组回顾临床病例, 挑选了其中部分典型案例进行解读。同时也对国内外NGS检测最新进展进行认真分析、讨论和总结, 增加了同源重组修复缺陷（homologous recombination deficiency, HRD）及实体瘤微小/分子/可测量残留病灶（minimal / molecular / measurable residual disease, MRD）相关内容, 制定了《肿瘤二代测序临床报告解读共识》, 旨在帮助临床医生梳理NGS报告解读逻辑, 快速抓取关键信息, 同时尽可能规避不正确的解读基因组信息导至的潜在危害, 最终做出正确的临床决策, 为患者带来更多的临床获益。

每个肿瘤基因组中可能存在数百至数千个体细胞突变, 其中许多是相对个体化的变异。对NGS鉴定出的多个基因变异（genomic alterations, GA）进行优先级排序是一项重大挑战。这些基因变异主要包括单核苷酸变异（single-nucleotide variant, SNV/single-nucleotide polymorphism, SNP）、短片段插入/缺失突变（Indel）、重排（融合）、拷贝数变异（copy number variation, CNV）及其他复杂突变等[1]。部分变异出现在生物学及临床相关、甚至是分子治疗潜在靶标的肿瘤基因中, 但并非所有肿瘤相关基因发生的变异均为（潜在）功能性变异, 更多的基因变异尚无明确的生物学和/或临床意义。随着高通量测序分析进入临床领域, 产生了大量数据, 而如何及时、准确的将测序发现的肿瘤基因组变异信息转化为临床医生可读取并用于指导临床决策的结构化循证报告（structured evidence-based reports）, 正变得越来越重要[2]。本次从临床靶点或驱动基因相关体细胞变异注释及解读、NGS报告解读及临床决策、可报告范围及质量控制3个方面对NGS临床报告解读作以指引, 并增加HRD及实体瘤MRD相关解读内容, 以更加贴合国内外最新进展。

基于NGS技术检测肿瘤体细胞变异的实验流程可概括为以下几个主要环节：样本采集及质量控制、DNA提取、文库制备、测序及基因组数据生成。而数据分析可进一步拆解为3个流程：变异识别（variant identification）、变异注释及过滤（variant annotation and prioritization）、变异的临床解读（interpretation of clinical significance）。其中, 变异识别、注释及过滤经由生物信息学工具实现; 而临床解读则需要基于严格的分级逻辑, 整合当前公共数据库及已发表文献的海量信息, 特别是变异-药物敏感性信息, 建立基因变异的临床解读知识库, 最终将与送检样本的对应癌种及检出的基因变异相匹配的临床意义（如药物敏感性信息）及其证据级别呈现在NGS报告中[3-5]。

目前有多个循证分级系统可用于指导基因体细胞变异的临床解读, 包括2017年美国分子病理学协会（Association for Molecular Pathology, AMP）/美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology, ASCO）/美国病理学家协会（College of American Pathologists, CAP）联合制定的体细胞变异解读指南; 2018年欧洲肿瘤内科学会（European Society for Medical Oncology, ESMO）发布的分子靶点临床可操作性量表（ESMO Scale for Clinical Actionability of molecular Targets, ESCAT）; 以及纪念斯隆-凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center, MSKCC）的精准医疗肿瘤数据库（Precision Oncology Knowledge Base, OncoKB）证据等级规则。总体而言, 无论哪个分级系统都遵循一些共性原则, 包括循证、跨癌种处理等, 故其中并无优先推荐者。临床医生在阅读1份NGS报告时应先了解其变异解读依据的证据分级原则及其采用知识库的局限性, 以帮助自己更好的理解报告内容。

根据2017年AMP/ASCO/CAP联合制定的体细胞变异解读指南[6], 体细胞变异在不同癌种中对应的药物敏感性证据分为4个等级：A级, 美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准或专业临床指南推荐; B级, 经具有足够统计学效能的临床研究证实、获得该领域专家共识; C级, 其他癌种中的A级证据（跨适应证用药）、或已作为临床试验的入组标准; D级, 临床病例报道或临床前证据支持。体细胞变异对特定肿瘤的诊断及预后价值, 亦给出相应分级：A级, 专业指南中定义的特定肿瘤的诊断/预后因子; B级, 经具有足够统计学效能的临床研究证实其诊断/预后价值; C级, 多项小型研究支持其诊断/预后价值; D级, 小型研究或个案报道提示其辅助诊断/预后价值（独立或联合其他标志物）。

基因变异按照其临床意义的重要性分为4类变异：Ⅰ 类变异, 有重要的临床意义, 具有A级或B级证据; Ⅱ 类变异, 有潜在的临床意义, 具有C级或D级证据; Ⅲ 类变异, 临床意义不明; Ⅳ 类变异, 无害或可能无害, 详见图1。

图1 AMP/ASCO/CAP指南：基于证据的体细胞突变分类^[6]Fig.1 AMP/ASCO/CAP guidelines：Evidence-based variant categorization^[6]

该体细胞变异解读指南在国内影响范围最广, 许多第三方NGS检测公司的临检报告即遵循该指南的分级原则对基因变异进行解读, 详见表1。

表1 NGS报告体细胞突变证据分级标准Tab.1 Categories of clinical and/or experimental evidence for the interpretation and reporting of somatic variants

ESCAT是由ESMO转化研究和精密医学工作组（Translational Research and Precision Medicine Working Group, TR and PM WG）发起建立的、基于临床靶标相关证据的基因变异临床分类系统[7], 于2018年发表, 将基因变异分为6个级别：Ⅰ 级, 可用于常规临床决策的靶点, 如乳腺癌的HER2扩增和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的EGFR敏感突变, 其中Ⅰ -A级突变是基于前瞻性临床研究已有了显著生存获益的靶标突变类型; Ⅱ 级, 已有证据表明患者将受益于针对性靶向治疗, 但仍需更多数据证实, 如PI3K通路中的AKT1、PTEN突变; Ⅲ 级, 在其他肿瘤类型（而非该患者肿瘤类型）中已证实临床获益的靶标性基因变异, 如NSCLC以外肿瘤中的EGFR19del突变; Ⅳ 级, 仅有临床前证据支持靶标性的基因变异; Ⅴ 级, 有证据表明针对此类变异的靶向治疗可获得客观缓解, 但缺乏有临床意义的生存[无进展生存期（progression-free survival, PFS）或总生存期（overall survival, OS）]获益, 或可支持联合治疗策略; Ⅹ 级：已证实缺乏临床价值（而非“ 尚无证据支持” ）, 不应影响临床决策。

OncoKB是由MSK癌症中心维护的精准医疗肿瘤数据库。该数据库旨在提供详细的、基于证据的基因组变异相关信息, 以帮助临床医生进行治疗决策。数据基于FDA、NCCN、ASCO指南等权威资料及其他科学文献、以及疾病专家小组的建议, 对不同变异的药物预测价值进行证据分类[8]：1/2级, FDA认可、或被认为是临床标准（standard of care, SOC）生物标志物, 可预测在特定疾病背景下对已获批药物反应的变异; 3级, 基于对临床试验中待测目标药物的有希望的临床数据, 被认为可预测药物反应的变异; 4级, 根据对临床试验中待测目标药物的令人信服的生物学证据, 被认为可预测药物反应的变异。

一份结构化循证报告的背后, 需要基于特定逻辑建立临床解读知识库框架, 并通过对开源知识库及海量科学文献的信息甄别、分级、编辑, 不断完善机构内部临床解读知识库。通过生物信息分析流程将基因变异识别、注释、过滤后, 可报告变异进入临床解读知识库进行变异、癌种、证据匹配, 形成可读的结构化NGS临床报告[9], 最终对其进行解读及实施临床决策, NGS报告解读决策树详见图2。

图2 NGS报告解读决策树缩写：LOD, limit of detection, 最低检测限; VUS, variants of uncertain significance, 意义未明变异; ACMG, American College of Medical Genetics and Genomics, 美国医学遗传学与基因组学学会; CHIP, clonal hematopoiesis of indeterminate potential, 意义未明克隆性造血Fig.2 Decision tree for the interpretation of gene variants

当临床医生面对1份体细胞变异“ 全阴报告” （即1份样本未能检出任何肿瘤体细胞突变）时, 应首先考虑以下两点：

（1）送检样本是肿瘤组织、外周血循环游离DNA（circulating free DNA, cfDNA）或其他; 结合样本质控信息及患者治疗史, 综合判断样本中是否含有足够肿瘤成分, DNA总提取量和/或肿瘤占比是否可能低于NGS的LOD。

（2）选择的NGS panel（尤其是仅包含数个至数十个基因热点区域的小panel）是否与患者的肿瘤类型相匹配, 即该肿瘤常见变异是否能被该panel覆盖。

以上评估可以帮助我们判断, 该“ 全阴” 结果是提示“ X基因野生型” 可能性大, 还是“ X基因状态未知” 可能性大。比如1份血检全阴报告, 采用panel针对泛癌设计、覆盖上百基因的热点区域, 对目标癌种常见变异的覆盖度> 90%, 此时的全阴, 很可能仅提示肿瘤全身负荷较低或其他原因（如患者正接受有效的抗肿瘤治疗）导至释放入血的循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）含量极低、未达检测平台的LOD。这种“ 全阴” 不能反映肿瘤基因组变异状态, 仅能提示“ 基因突变状态未知” 。当然, 这种血检全阴报告可以提供突变谱以外的其他信息, 在特定场景下提示一定的预测、预后价值。

基因融合在血液肿瘤或者实体瘤中均可检出, 目前FDA及NMPA针对ALK、ROS1、RET、FGFR2和NTRK1/2/3等融合靶点已经批准了多款相应的靶向药物。由于DNA测序（DNA sequencing, DNA-seq）检测融合需要同时覆盖外显子和内含子, 而内含子区域常见重复区、同源区, 干扰DNA-seq检测灵敏度; 同时有些基因断点可能发生在多个内含子, 且内含子长度大, panel设计往往难以全部覆盖。因此从融合产物功能性预测及检测全面性而言, RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）更灵敏更直接, 同时验证功能。RNA-seq更具优势, 有利于临床应用。

MET14外显子跳读突变是已明确的NSCLC驱动变异, 约3%~5%的NSCLC携带MET 14外显子跳读突变[10, 11, 12]。日本已批准tepotinib治疗MET 14外显子跳读的NSCLC患者。FDA已批准capmatinib用于MET 14外显子跳读的NSCLC患者。赛沃替尼已获NMPA批准用于携带MET 14外显子跳读的晚期NSCLC患者。由于MET 14外显子发生的突变大部分位于外显子起始端或末端和内含子交接处, 突变分布的区域较广泛, 而以DNA为基础的NGS探针所需覆盖的区域广泛, 一旦不能全面覆盖这些突变的区域, 可能会造成漏检。而在RNA层面上, MET 14外显子发生的突变会直接导至整个14号外显子的缺失, 因此当检测到MET 13外显子后连接的是15号外显子, 就能说明存在14号外显子跳读突变, 探针覆盖区域小, 不容易产生漏检。

MSK癌症中心的1项大样本肺腺癌研究中, 使用DNA进行NGS测序（MSK-IMPACT 468 genes DNA panel）, 检出的驱动基因阳性率为76.6%（1 933/2 522）, 其中融合阳性率为7.7%（195/2 522）, MET 14外显子跳读突变阳性率4.7%（119/2 522）。在DNA-seq检测为驱动基因变异阴性的232例患者中, 经RNA-seq（MSKCC-Fusion）又检测到了36例融合及MET 14外显子跳读突变, 其中融合阳性患者为30例, 6例MET 14外显子跳读突变, 其中10例患者接受了相应靶向治疗, 临床获益率80%[13]。2020年ASCO上公布了1项研究, 比较了DNA检测与RNA检测对MET 14外显子跳读突变的检出率。研究发现, 在对644例肺腺癌患者使用以DNA为基础的NGS检测时, 共检测到16例MET 14外显子跳读突变（2.5%）, 而当进一步使用以RNA为基础的NGS技术对剩下的DNA检测阴性样本进一步检测, 又检出了额外9例MET 14外显子跳读突变[14]。

基于以上情况, NCCN的NSCLC指南（2021 v1版）建议, 如果使用DNA检测NGS技术没有检测到任何驱动突变时, 建议补充以RNA为基础的NGS检测, 以增加基因融合及MET 14外显子跳读突变的检出率。未来以DNA与RNA检测相结合为代表的多组学检测, 将会为受检者提供更全面、精准的检测结果, 有望成为基因检测的新方向。

临床医生在拿到1份NGS阳性报告时, 可能对其中检出的突变/重排的丰度（allele frequency/fraction, AF）及CNV的拷贝数（copy number, CN）存在疑问。基于不同的样本类型, 对AF及CN的理解可能存在一定差异。

2.2.1 基于组织样本的NGS检测

首先对AF绝对数值的解读。对于组织检测结果, 可以基于如下公式, 根据X基因突变（或重排）的AF以及样本中的肿瘤占比, 粗略判断该变异在肿瘤中的克隆占比：

一般情况下, 肿瘤细胞中的突变, 尤其是癌基因突变（如EGFR、KRAS活化突变, ALK、ROS1重排）以杂合突变存在; 但上述公式未考虑潜在的拷贝数变异（比如EGFR 19del伴扩增）的影响。而抑癌基因的功能缺失性（loss of function, LOF）杂合突变, 则可能由于杂合性缺失（loss of heterozygosity, LOH）的存在而影响克隆占比的估算。拷贝数为2的LOH（中性拷贝数LOH）可类比纯合突变进行肿瘤克隆占比的估算, 而拷贝数缺失的LOH则更加复杂。例如, 1份晚期肠癌组织样本中, 检出NTRK1重排（不伴CNV）, AF为10%; 而病理评估提示该样本肿瘤占比约为50%; 根据公式计算（考虑为杂合突变）, 携带NTRK1重排的肿瘤细胞仅占所有肿瘤细胞约40%, 提示NTRK1重排仅存在于肿瘤的1个亚克隆。当然, 用于病理评估的样本仅为1张切片, 不能完全代表检测样本整体; 且病理评估还可能受局部肿瘤坏死等因素干扰, 故病理评估结果仅供参考, 由此推算出来的变异克隆占比与实际情况可能存在一定偏差。而当样本无法进行病理评估时（比如病理蜡卷标本）, 则只能以该样本中检出变异的最高突变丰度（maxAF）来反推可能的肿瘤占比。比如1份肠癌样本中同时检出KRASG12D突变、SMAD4突变和NTRK1重排, KRAS突变作为maxAF丰度为25%, 反推该样本肿瘤占比约为50%, 以此为基础评估NTRK1重排的克隆性。

其次对AF相对数值的解读。组织样本中不同变异的相对丰度同样可以提供很多信息。比如1份肺癌组织样本中, 同时检出EGFR 19del和ALK重排, 二者相对丰度为5:1; 结合患者既往EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）长期治疗史, 我们有较大把握推断, 该ALK重排为获得性耐药机制, 而非EGFR/ALK双原发肿瘤。另外, 大样本研究显示, 晚期肠癌患者cfDNA样本中检出的可靶向TRK重排（融合）多以亚克隆形式存在, 即对比主干突变maxAF的相对丰度低于50%。

最后对CNV的解读。CNV及基因组上部分区域的扩增或缺失。面对1份NGS报告, 首先需要注意CNV有不同的报告形式, 最常见的包括CN及扩增倍数（ratio）。前者即1份样本提取的DNA混合物（包含肿瘤DNA及非肿瘤来源DNA）中检出的某基因的平均拷贝数（正常CN为2）; 后者即前者与2的比值。基于NGS检测得到的CNV的非校正CN或ratio值与荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）检测得到的CN值或ratio值之间存在较大差异, 详见表2。

表2 CNV不同报告形式：NGS vs. FISHTab.2 Different reporting forms of NGS and FISH

在已知肿瘤细胞占比的情况下, 可通过以下公式粗略换算目标基因的肿瘤细胞CNV（即校正CNV）：

假设肿瘤细胞中目标基因CN为20, 当肿瘤占比仅为10%时, 实际检出CN值仅约为3.8。由于正常DNA的稀释作用, 当1份样本中肿瘤占比低于20%（即maxAF< 10%）时, CNV的检出敏感性显著降低。

2.2.2 基于外周血cfDNA的NGS检测

NGS血检, 检测对象是血浆中的cfDNA。虽然科研领域人们可以通过一些方法（比如根据cfDNA片段长度的差异）评估ctDNA的实际含量, 但在实际临床应用及大多数科研发表中, 仍以血浆样本中检出体细胞变异的maxAF作为ctDNA含量的替代指标[15]。可针对某一肿瘤患者进行不同临床节点的血检动态监控, 以maxAF反映外周血ctDNA含量的动态变化, 以此反映全身肿瘤负荷变化、预测治疗效果及生存预后。比如, 对于初诊晚期肿瘤患者, 基线的ctDNA含量高低与全身肿瘤负荷相关; 而治疗开始后（3~8周）ctDNA的早期变化趋势可预测当前治疗的总体效果, ctDNA快速清零预示更长的PFS及OS。这种变化趋势比影像学评估更加快速敏感, 比如影像学评估同为SD的患者, ctDNA早期清零与长PFS显著相关; 免疫治疗假性进展的患者, 治疗初期即表现为ctDNA快速下降甚至清零[16]。ctDNA水平的监测可以辅助评估对靶向治疗应答情况, 获悉疾病进展及耐药机制, 对指导后续靶向治疗有较强的指导意义。

例如, 1例Ⅳ 期肺癌患者NGS组织活检检出EGFR L858R（突变丰度84.3%）和TP53 R273C（突变丰度44.0%）共突变, 接受厄洛替尼一线治疗, 期间行外周血NGS动态监测, 经过治疗后病情好转, 病灶缩小, 胸水明显减少, 临床评价疾病稳定（stable disease, SD）（病灶缩小）, 血检EGFR L858R（突变丰度3.21%）和TP53 R273C（突变丰度0.22%）, 经厄洛替尼治疗1年后复查血检NGS发现EGFRL858R和TP53 R273C突变丰度明显升高（50.99%, 7.20%）, 同时检出较高丰度的EGFR T790M突变（7.60%）。患者2个月后出现咳嗽, 复查影像学提示临床疾病进展, 提示NGS血检基因异常的发现可能比临床进展更早, 为加强随访, 甚至提前调整治疗提供重要参考。随后根据NGS血检结果（EGFRT790M突变）给予二线奥希替尼靶向治疗1个月后, 病灶缩小, 复查NGS血检EGFR T790M、EGFR L858R和TP53 R273C突变丰度均明显下降（0.14%、5.28%和0.61%）, 与临床病情变化相符。

另外需要注意的是, 由于多数肿瘤患者外周血maxAF< 10%, 对CNV的检测敏感性明显低于突变、重排等变异形式。

2.2.3 基于外周血ctDNA MRD的检测

MRD具有多种表述：微小残留病灶（minimal residual disease）、可测量残留病灶（measurable residual disease）和分子残留病灶（molecular residual disease）。其概念由血液肿瘤逐步延伸至实体肿瘤, 主要指经过治疗后, 传统影像学或实验室方法不能发现, 但通过液体活检发现的癌来源分子异常, 是体现在治疗后体内存在残留肿瘤细胞的生物标志物。由于残留的癌细胞数量较少, 无法通过传统方法检测到。因此, MRD检测对于检测技术的敏感性有极高的要求。随着分子生物学技术的发展, 特别是NGS技术的深入应用, 对MRD的检测已应用到大量临床研究中。

在实体肿瘤中, MRD与患者术后生存复发之间相关性证据已在乳腺癌、消化道肿瘤、肺癌等中得到印证。基于ctDNA的MRD检测已成为临床越发关注的一个重点。很多研究表明MRD能够早于传统影像学发现肿瘤复发, 是一个优良的预后指标, 也有越来越多的证据表明MRD有望成为一个预测指标。目前, 常用的MRD检测技术包括数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction, dPCR）、NGS等。其中, NGS作为新兴的MRD检测方法, 对于预后有更准确的评估, 已受到国内外专家认可并推荐。基于NGS检测MRD检测的基本策略, 包括肿瘤先验分析（tumor-informed assays, 个体化定制或NGS panel）和肿瘤未知分析（tumor-agnostic assays, NGS panel和多组学技术）, 两种策略目前均处在探索阶段, 需要前瞻性研究确定其敏感性、特异性和临床预测及应用价值。虽然2021年《非小细胞肺癌分子残留病灶专家共识》已提出的标准：基于NGS的突变检测技术, 所选用的多基因panel中必须覆盖患者Ⅰ /Ⅱ 类基因变异, 基本技术标准是可稳定检测出丰度≥ 0.02%的ctDNA[17]。但因目前各家检测机构其技术路线、检测性能、生信分析、MRD阳性标准尚不能统一, 业界也尚未形成标准, 故目前尚无法对MRD检测报告形成统一的解读模式。目前国际上基于NGS开发检测MRD的主要产品见表3[18]。

根据不同NGS panel的可报告范围, 1份NGS阳性报告中的变异可能有多有少。对于不同情况, 临床医生应采取不同的解读逻辑流程。对于多基因变异、特别是多个潜在驱动变异共存的情况, 要结合肿瘤类型、既往治疗史、相对突变丰度、既往分子检测结果等信息综合判读, 以推测不同变异之间的逻辑关系（原发性vs. 获得性, 主克隆vs. 亚克隆, 敏感克隆vs. 耐药克隆）, 指导后续治疗。

例如, 1例初诊晚期肺腺癌患者, 行组织NGS检测发现其携带EGFR L858R突变（突变丰度56%）, 同时也携带ERBB2基因S310F突变（突变丰度12%）, 从NGS检测结果推测携带EGFRL858R突变的细胞为肿瘤主克隆, 而ERBB2仅为致病性相对较弱的亚克隆。该患者接受一线奥希替尼治疗疗效为部分缓解（partial response, PR）, PFS达5个月。

另外, 临床上关于判断多原发癌是一直存在的难点, 目前关于多原发癌与转移癌的区分并没有金标准, IASLC提供了一些参考标准：（1）组织学类型：不同的组织学类型可以考虑为是多原发, 比如1个是鳞癌, 1个是腺癌; 但是相同的组织学类型并不能明确是转移癌; （2）遗传特征：用PCR, FISH, NGS等方法检测不同肿瘤的遗传特征, 而基因型完全相同考虑可能是同一个肿瘤发展而来; （3）建议整合所有的信息来进行综合判断, 包括影像学、活检、临床特征、分子特征等, 不同的因素有不同的权重, 应通过多学科会诊来判断[20]。例如, 1例患者查体发现双上肺结节, 胸部CT考虑恶性肿瘤性病变, 完