分子｜ROX染料在RT-PCR中的作用

大家好，今天我们来讨论一下，我们经常提到的ROX是什么东西，以及它在RT-PCR中的功能是什么？

和FAM，VIC这样的数字荧光染料很像，ROX也是一种荧光分子，当它出现在反应中时，实时PCR仪器可以检测到它发出的信号值。

但是，与其他那些染料不同，ROX是一种被动的染料，这也意味着它的荧光值水平不会因为随DNA的扩增而发生改变，而是一直保持在一个稳定的水平上。

现在，问题来了，为什么我们要设置这样一种稳定的染料，它有什么作用？

实际上，在任何RT-PCR系统中，有几个潜在的来源会激发报告基团，从而形成‘本底’。实际上，任何检测系统也都有这个问题。这些因素包括：

➤ 不均匀的照明；

➤ 各孔光学的轻微变化；

➤ 凝结量的差异。

ROX在这里就起到一个扣除本底的作用，它会对这些和其他变异源进行归一化处理，并在此过程中提高了数据的精确度，这就像我们在Elisa试剂当中要设计阴性对照一样。

它是这样工作的。

在反应板上，我们选择两个特定的孔。将完全相同数量的样品移入每个孔中，我们将周期设定为30，然后进行RT-PCR扩增。

过了一段时间之后，反应完成了，仪器会读取我们的报告基团信号值，并且给出读数。

我们认为两个读数是会相同的，因为我们是从相同的反应成分开始的，但是，很不幸，由于这两个反应孔中存在一些细微的偏差（对于RT-PCR这种呈指数扩增的系统来说，细微偏差也会带来巨大的变化），所以反应结果并不一致，这也意味着，这些样本的测量结果是不正确的。

幸运的是，我们在这两两反应孔中也有ROX，和其他样本测量结果一样，它也在被测量，而且它看上去就像其他样本测量结果的本底。这也就是说，系统的不一致性对ROX的影响与对测量结果的影响程度是相同的。

重要的是，仪器将在每个周期的每个孔中收集成对的测量值，然后在运行结束时用每个报告器的测量值除以其相应的ROX测量值，得出的结果被称为Rn，代表归一化报告。这样，我们的数据的精度会大大增加。

当我们在设计PCR试剂时，有两点需要特别注意。

第一点是需要注意我们购买的MIX中，是否已经包含了ROX，很多厂家销售的MIX当中已经有经过优化的ROX，所以我们没有必要再添加它。

第二点是需要注意我们PCR软件的设置，很多PCR软件会默认设置使用ROX染料，并且进行归一化计算。如果由于某种原因，你决定使用不含ROX的MIX，那么我们需要修改软件设定，将被动参考模改为无。

否则，软件就会试图对一个不存在的数字进行归一化，这会造成很大的问题。