大家好,在今天这篇文章当中,我们来讨论一下什么是RT-PCR的阈值,它该怎么设置? 阈值是我们扩增图中的一条水平线,可以在Y轴上向上或向下移动。它的目的就是告诉软件应该从哪里开始读取数据。 但是,我们也不能在Y轴上将阈值随意放置,有一些区域我们需要避免。 如果阈值设的过低,就会进入到噪音部分,那么检测的Ct值结果就会陷入到噪音当中,但如果,我们把阈值设的过高,就会进入线性增长期或平台期,这里的数据很不容易预测,对结果的影响也很难预计。 那么,有没有一个位置,在这里所有曲线都是直,而且平行的,可以让我们更好对结果做出判断? 有的,这个位置一般处于指数增长期的中间,或者稍高一点的位置,这里也是复制精确度最高的地方。 对于一个真正稳健的分子诊断试剂,大部分情况下都可以很容易的找到一个好阈值位置。因此,对于实时PCR软件而言,它会将默认值设置为自动阈值,这意味着在我们点击分析的一瞬间,软件就会为我们设定阈值。 但请注意,一般来说,软件会为每个检测项目分别设置不同的阈值,这主要因为不是所有的检测项目都有相同的最佳阈值。但如果有需要的话,我们可以将任何一个或所有的阈值都切换到手动模式,然后用鼠标向上或向下移动该线。一旦阈值设置完毕,点击分析,所有的样品都会得到各自的Ct值。 细心的读者可能会问,如果阈值可以向上或向下移动,不是会改变Ct值吗? 确实是这样,但只要我们把阈值牢牢地保持在指数扩增期内,任何两个样本之间的相对或ΔCt就保持不变。 这一事实使我们进行一些有意思的工作,如计算不同样品之间基因表达的倍数变化,以及从标准曲线中获得数量信息。 |