如何针对病原检测样本提取高质量核酸

工欲善其事必先利其器，拿到一件趁手的工具，事情也就成功了一半。在核酸检测产品的开发过程中，原材料的筛选是影响产品最终性能的关键性因素之一。而核酸检测的第一步样本核酸的提取富集更是重中之重。针对感染性样本的核酸检测，为了保证检测结果的灵敏度和准确性，获得高质量核酸，则有以下问题需要考虑：

做病原检测时的真实样本较为复杂，首先样本类型多样，如血液、唾液、痰液、脑脊液、尿液等，不同的样本类型其基质差异非常悬殊。其次即使同类型的样本状态如肺泡灌洗液也会因患者的个体差异而不同，受治疗、用药的不同及病情进展的不同使得肺泡灌洗液内的成分发生明显变化。因此核酸提取试剂盒厂家需要考虑不同样本类型的兼容性。

真菌、DNA病毒、RNA病毒、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等等，不同的病原体类型意味着对破壁及核酸释放提出不同的要求。在同一份提取的样本中既能保证真菌的核酸释放，又能保证低丰度RNA病毒核酸的完整性至关重要。

核酸提取后的下游应用多是基于生物酶的反应，而生物酶保持最佳活性对反应缓冲液中的盐离子浓度、pH及有机溶剂等具有较为严格的要求，因此提取的核酸需要保证一定的纯度。而核酸提取产物中的抑制剂成分主要有两个来源，一是样本，二是提取试剂本身。所以核酸提取试剂盒需要保证对于样本中非核酸成分的去除，同时提取试剂本身不包含酶的抑制剂成分。

当产品投入到实际应用时，面对大量的待测样本，为了提高整个检测流程的效率，同时降低人为因素带来的误差及人力资源的投入，核酸提取的步骤及试剂应能够匹配自动化平台，进而实现对样本的高通量高效率的提取。

在新冠大流行期间，LGC Biosearch Technologies™ 一直作为寡核苷酸、酶和样本制备解决方案的可靠关键组份供应商为诊断行业提供服务。

为更好的满足客户需求，并推动分子诊断产品的高质量发展，LGC Biosearch Technologies发布了全新的磁珠法病原体核酸提取试剂盒（即：sbeadex™ Pathogen Nucleic Acid Purification Kit），旨在帮助客户实现针对不同样本、不同病原体进行同步的高效率提取，为下游应用提供最佳的核酸提取物。

已验证过的常见感染类型样本主要有拭子（UTM/VTM）、痰液、唾液、全血、血浆、血清、尿液、粪便、脑脊液。如实验结果图1，该试剂盒可以完成对不同样本中掺入病原体的提取，同时结果表明，对于不同的样本，裂解时间的长短存在一定的优化空间。如全血RNA病毒提取裂解3分钟时间最佳，裂解20分钟时样本内的病原体核酸可能会发生降解。

图1 不同基质样本掺入RNA病毒提取及最佳裂解时间验证

与市场上主流的提取试剂盒对比，将4倍梯度稀释的SARS-CoV-2标准品掺入到全血样本，三个梯度分别含有1200 (neat)，200 (1 in 4)，75 (1 in 16)拷贝。提取后进行RT-qPCR验证。结果如图2所示，对于不同病原体含量的样本，sbeadex核酸提取试剂盒的提取性能均优于同类厂家产品。

图2. 与其它厂家针对不同病原体浓度样本提取效果对比

接下来对常见的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌分别进行梯度稀释掺入样本的核酸提取测试。结果如图3所示，不同掺入量样本与最终的qPCR结果呈现良好的线性关系。说明该试剂盒可以对不同浓度的不同类型病原体的核酸成功进行提取。

使用sbeadex病原体核酸提取试剂盒和oKtopure成功实现病毒RNA的自动化提取。oKtopure的优化方案使用减少的洗涤缓冲液体积，洗脱体积为50μL，每8个96孔板的（包括平板制备步骤）的提取总时间为3小时9分钟。NPS（鼻咽拭子）和SS（痰液）样品的结果详见表1。NPS的LoD为75拷贝，而SS为150拷贝。

所有 sbeadex 试剂盒均使用表面修饰的超顺磁性磁珠，通过一种新型的两步结合机制结合核酸（图4）。

首先，核酸通过极性相互作用吸附在磁珠上，其次通过亲和力驱动的核酸接头与磁珠结合。第二个结合步骤允许使用水基洗涤溶液进行最终洗涤步骤，无需进行干燥，避免过度干燥可能带来的核酸质量的损害，并将最终进入洗脱液的乙醇降至最低。该两步结合机制及无乙醇洗涤可以帮助客户获得高纯度高质量的核酸提取产物。

图4. Sbeadex核酸提取原理