实时定量PCR探针的合成原理、设计方法、原则、标准、主要事项！

在实时定量PCR反应中，杂交探针与插入染料如SYBR Green相比是更好的选择。荧光标记探针可以提高实时定量PCR结果的效率、灵敏度和特异性。而且定量PCR可以在一个反应里同时检测多个目标基因。而多重PCR分析的优点有以下几个方面，省钱省时省力、 所需样品量少、消除移液误差、可以在一个反应里设置内部对照、 便于筛选等。

双标探针的原理:

PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；PCR 扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的5' －3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。

荧光共振能量转移(FRET)技术的原理:

两条线性寡核苷酸探针，其中一条的3 ‘端标记荧光激发基团，另一条的5 ' 端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。

分子信标的原理:

分子信标技术是在同一探针的两末端分别标记荧光基团和淬灭基团，为一种标记荧光的发夹探针。在未与模板发生杂交前该探针分子呈发夹结构，结合在其两端的荧光基团距离上接近，产生能量转移效应，不发生荧光。当该探针与模板杂交，使荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析。使用无荧光的淬灭基团可以提高实时定量PCR、多重PCR、FRET实验中的灵敏度。

双标探针和5’核酸酶试验引物的设计准则：

双标探针(荧光淬灭探针或称FQ探针) 在其5’端和3’端分别有一个荧光报告和淬灭基团。利用Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性，这些探针可以用于定量PCR体系。靶序列的特异性探针和特异性的PCR引物同时使用，设计的该探针在上下游PCR引物的范围内退火。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性将荧光报告基团从探针上切割下来。随着PCR循环数的增加，游离报告基团的数量不断的增加，实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号，从而对靶序列进行定量分析。

在设计这些双标探针的时候需要谨记以下几个要点：

1. 探针的结合位置很重要，先设计好探针再设计PCR引物。

2. 探针的结合位点应该靠近扩增产物的中心，扩增产物的长度应该在50-150bp之间。

3. 探针的解链温度应该在68℃至70℃之间。

4. 探针的长度最少20bp，否则容易发生非特异性结合。

5. 尽量避免在探针的5’端出现dG ，因为dG 是一个较弱的淬灭剂，任何dG 都要离5’端至少两个碱基。

探针的设计标准：

G-C 含量:：30~80%

多聚碱基:：避免出现多个重复碱基，特别是4个或者多于4个G。

末端构成:：在末端不能出现G。

退火温度:：68-70℃

DNA链：挑选C多余G的链。如果使用互补链，确保C不存在于3’端。

长度:：少于30个碱基。

设计：淬灭基团在3’端，荧光染料在5’端。

引物的设计标准：

G-C含量: 30-80%

多聚碱基: 避免出现多个重复碱基，特别是4个或者多于4个G

末端组成: 3’端的5个碱基中不能多于两个G或者C，建议A出现在3’端，便于引物二聚体更加高效的降解。

退火温度:：58-60℃

产物: 50-150 个碱基

设计: 在设计完探针之后再设计引物，尽量紧靠探针但是不要发生重叠。其中的一条引物可以和外显子交接，用于扩增mRNA。

分子信标的设计原则：

分子信标的5’端和3’端也分别有一个荧光报告基团和一个淬灭基团。当荧光染料和淬灭基团接近的时候，探针会形成一个发夹结构。在PCR中，分子信标是特别针对目的基因设计的，分子信标探针可以使PCR引物退火。在PCR的退火阶段，探针和它对应的靶序列杂交，发夹环解开后，荧光报告基团和淬灭基团分离，可以发出一个荧光信号。信号的强弱和靶序列的多少成正比，通过实时监测这个信号，可以对靶序列进行定量。为了精确检测PCR过程，分子信标必须和它们的靶序列在退火阶段杂交成功，而游离的分子信标应该继续保持封闭状态，不会发出任何荧光。通过适当选择探针的长度和靶序列的长度，当温度高于退火温度7-10℃时，探针能够从靶序列上脱离下来，这样的探针序列的长度就很适宜。探针与靶序列的解链温度可以用“GC百分比”原则预测，很多设计探针的软件包都使用这个原则。在添加茎环区序列之前，这个预测方法只能用在探针序列的设计上。实际应用中，探针序列的长度范围通常是15-30个核苷酸。

上图显示的是分子信标在实时定量PCR中的应用原理

A: 不和靶序列结合的时候，分子信标呈现发夹结构。荧光报告基团和淬灭基团的紧密结合阻止了报告基团释放荧光。B:在PCR的退火阶段，分子信标和靶序列杂交结合，将荧光染料和淬灭基团分离，导至荧光染料释放信号。信号的强弱和靶序列的多少成正比，实时监测荧光信号可以对靶序列进行定量。

· 茎环区的解链温度比退火温度高7~10℃

· 探针的环状区需要15~30碱基

· 茎环区的两边长度应该在5~7 碱基之间

· 扩增产物的长度少于150 bp