技术｜DNA和RNA的变性与再变性

我们体内的DNA是一个双链的α型螺旋，而RNA由于部分内部碱基配对而显示出独特的二级结构。在这些分子构象下，DNA或靶点RNA不能与探针（或引物）杂交。只有当探针和靶点分子处于单股的「开放线圈」构象时，杂交才有可能（见图1）。

图1 | 重新变性和变性条件下dsDNA的变性和重新变性。dsDNA的构型在很大程度上取决于化学和物理因素

（a）高温、极端的pH值、变性物质（如甲酰胺）和低浓度的盐会破坏Watson-Crick碱基配对，导至单链分子处于开放线圈结构（ID）。在适当的条件下，原始形式的再熟化是可能的；然而，在复杂的、高分子量的DNA中，这个过程最初会运行得很慢。当开环结构在冰上被冷却时，两条链都不会再变性。在一定条件下，将形成一个具有内部碱基配对的紧凑线圈（IA），或者分子将保持在开放线圈配置（IB）。对核酸构型的操作是杂交和PCR测定的基本原则。

（b）用荧光染料（如EvaGreen®）观察dsDNA的变性情况。从65℃到95℃小幅度升温，使两条DNA链之间的碱基配对逐渐解开；富含AT的区域最不稳定，首先成为单链。相应地，荧光染料也会丢失。超过一定的温度，取决于碱基的组成和DNA的大小，所有的荧光色素将回到溶液中，荧光将变得最小。当使用荧光数据和温度时，熔融曲线可以直观地显示这一过程。当50%的碱基被解离时，荧光的损失是最迅速的。这个点要用数学方法计算，叫做Tm。

通过提高温度，原生DNA的碱基配对可以解开，同时分子变性为两条链子。

自从二十世纪中期在玻璃棒上分离出固体DNA的那一刻起，人们就开始研究dsDNA的变性。当固体双链DNA被加热时，它就会变成液体。这种相变被称为「融化」。RNA也可以变性。

加热溶液中的dsDNA会改变其物理化学特性。例如，260 nm处的紫外线吸收增加了40%，相当于单核苷酸的吸收（图2a）。

图2 | dsDNA熔化后紫外吸收光谱的变化

（a）dsDNA在25℃下的紫外光谱（蓝线）和融化后在82℃下变性的ssDNA，随后在冰上冷却以保持DNA分子的单链结构（红线）。180和300 nm之间的相对吸收。

（b）不同温度条件下样品在260 nm处的消光比。完全融化的DNA的最大吸收被调整为100%。50%的碱基配对被破坏的温度被称为Tm（融化温度）。

（c）富含GC的区域比富含AT的区域更难融化。在Tm温度下，大部分富含AT的区域将被融化。

（d）GC含量低的分子（35%）的绝对Tm值低于50%（b）或60%（d）的分子。

当单链分子被慢慢冷却时，双链构象（即碱基配对）会被恢复，这个过程称为重新变性。为了防止重新变性，（融化的）单链DNA或RNA分子需要在完全变性后直接在冰上冷却。通过这种方式，分子保持在单链的开放线圈结构中。双链DNA的碱基配对失去50%时的温度称为熔化温度（Tm）（图2b）。

图3 | 双链DNA分子的连接力

（a）双链DNA分子的剖面图，从右到左为糖-磷酸盐骨架（红灰色键）。氮基的方向是居中的。

（b）两个单链分子的GC（3）和AT（2）碱基对之间的氢键。

（c）dsDNA分子的俯视图，氮碱基的方向和A-T氢键为白色。

（d）芳香族环状结构的Pi-电子。

特别是，当各种破坏螺旋稳定的试剂结合在一起时，Tm明显下降。这种下降可以超过几十摄氏度。实际上，变性剂主要用于杂交和洗涤步骤中操纵反应条件。也有一些螺旋稳定剂可以增加Tm。

一个例子是Mg2+，作为一个二价离子，它与带负电荷的磷酸基团形成离子性非共价键。通过这种方式，双链DNA分子的稳定性将得到提高。单价离子（如Na+）的疏水特性在高浓度下也作为DNA稳定剂发挥作用。水分子通过偶极相互作用与dsDNA的氢键相互作用，并在低盐条件下降低氢键的稳定性。

总之，高盐溶液通过与水分子的偶极相互作用来稳定双链结构，而低盐则由于许多自由移动的H2O分子准备与氢键相互作用而具有破坏稳定的作用。

Tm的绝对值高度依赖于变性剂和/或稳定剂的选择。因此，引入了Tm=0的概念（图1a）。这包括在某些变性条件下，dsDNA分子的一半碱基不显示碱基配对。

熔解曲线非常陡峭，在Tm = + 10℃或Tm = -10℃时可以分别得到完全的单链和完全的双链分子。因此，在Tm = -15℃时有可能进行杂交，而工作温度的绝对值从37℃到60℃不等，这取决于加入更多或更少的破坏螺旋的试剂。

当变性条件被中和后，可以重新发生碱基配对。如果在正确的条件下，单链DNA分子重新饱和为双链形式，RNA可以重新获得其原始发夹环构象（见图1a）。

最初，氢键的形成将在许多地方开始。当非互补部分相遇时，这将停止。交替的释放和结合将继续下去，直到在多个地方形成了正确的起点。

随后，对于DNA来说，两条互补的链将重新结合成双链构象。分子越大，DNA序列的多样性越多，这个过程就会越长。对于大型复杂的DNA分子来说，重新变性可能需要几个小时甚至更长时间（图4a）。

在变性过程中，单个单链分子必须保持开放的线圈结构，从而使碱基充分暴露。因此，需要温和的变性条件，使完全匹配的双链得以形成。

图4 | 杂交显示为互换熔解曲线

（a）简单和复杂DNA的再成熟显示为完全恢复的碱基配对的比例。一个简单的poly（dA）/（dT）和一个非重复的小牛胸腺DNA之间的再成熟速度的差异可以是109倍。

（b）大量过剩的寡核苷酸（探针和引物）的反应平衡将朝着恢复双链结构的方向发展。寡聚物会很快与互补的碱基相遇。在PCR反应中，重新成熟的过程将长期发生。将产生更多的扩增子；互补的扩增子链将干扰引物退火。

碱基配对的完全恢复并不总是可行的。特别是，如果采用极端的变性条件，在温和的变性条件下没有足够的时间恢复碱基配对，或者单个核苷酸链冷却得太快，就会形成不可逆的变性DNA。如果冻干的DNA储存在高湿度的条件下或保持在室温以上，也会发生不可逆的变性的DNA。