Nature communications丨无分离和扩增步骤的数字免疫分析平台！

当前的2019冠状病毒疾病大流行证明，快速、高精度地检测疾病的能力至关重要。数字免疫分析由于其单分子检测和绝对定量的能力，在过去二十年中在概念上取得了显著进步。它们将分析物划分为微孔或乳液滴，作为独立信号放大和数字计数的小隔间，导至灵敏度比传统免疫分析方法（即酶联免疫吸附分析）提高103倍。尽管有这些优点，数字免疫分析具有复杂的分析步骤，例如多个清洗步骤、样品分割和测量前的信号放大，这些限制了其广泛应用。纳米颗粒（NPs）被用作标签，并提供了一种简化工作流程的替代方法。例如，通过亮场或暗场成像、干涉或荧光成像、表面增强拉曼散射和表面等离子体共振显微镜成像可以绕过信号放大步骤，而跟踪单个粒子的布朗运动可以实现无需清洗的均匀免疫分析的数字化。然而，这些技术仍然依赖于多步骤操作、繁琐的芯片制备、标签和先进的成像系统，目前仅限于实验室环境。

近日，来自美国的研究团队在杂志Nature communications上发表了一篇题为“Digital plasmonic nanobubble detection for rapid and ultrasensitive virus diagnostics”的文章。在这篇文章中，研究团队报告了一种基于数字等离子体纳米气泡检测（DIAMOND）的策略来对病毒进行快速敏感诊断的方法。等离子体纳米气泡是激光加热等离子体纳米颗粒（NPs）产生的瞬态蒸汽气泡，允许单个NP检测。使用金纳米颗粒作为标签和光流控装置，研究团队证明了DIAMOND实现了无隔室数字计数，并在无分离和扩增步骤的均质免疫分析中发挥作用。DIAMOND可以特异性检测鼻拭子样本中的呼吸道合胞病毒，检测限约为100 PFU/mL（相当于1个RNA拷贝/μL），与用于病毒检测的数字等温扩增相近似。因此，DIAMOND具有一步、单NP检测、室温下直接检测完整病毒、无复杂液体处理等优点，是一种快速、超灵敏诊断的平台技术。

图片来源：Nature communications

研究团队报告了一种基于数字等离子体纳米泡检测的简化数字免疫分析策略（DIAMOND）。等离子体纳米气泡（PNB）是指由短激光脉冲激发等离子体纳米颗粒（例如金纳米颗粒）产生的蒸汽气泡，并放大其固有吸收，以便通过二次探测激光进行检测。PNB的寿命为纳秒，对NPs的物理性质（如尺寸、形状、浓度和聚集状态）敏感。利用这些独特的特性，研究团队设计了一种光流控装置，使NP悬浮液在微毛细管中流动，其中两个对齐的激光束同步激活NPs和检测PNB（图a）。由于PNB是瞬态事件，并且激光脉冲之间没有串扰，DIAMOND创建了约16 pL的微尺度“虚拟检测区”，并以无隔室的方式计算“开”和“关”信号（图b，c）。尽管其检测方案类似于流式细胞术，但DIAMOND利用非荧光标记产生信号，并在无流动聚焦的情况下检测分析物。凭借快速读数和超灵敏检测，DIAMOND为开发无需分离、扩增和物理隔室（如液滴或微孔）的数字免疫分析开辟了可能性。

DIAMOND原理简介。图片来源：Nature communications

研究团队首先评估了DIAMOND对单个NP的检测能力。75 nm 金纳米颗粒悬浮液通过注射泵以6μL/min的流速注入200μm毛细管。图a中突出显示的每个PNB信号表示根据泊松分布检测到的单个AuNP。这一结果证实了DIAMOND对单个NP的检测能力，且DIAMOND是一种无校准技术，允许绝对量化。

通过DIAMOND检测AuNP和大小区分。图片来源：Nature communications

研究团队评估了DIAMOND检测NP异质群体的能力。其基本原理是，NP团簇或聚集体可能充当更大的粒子。首先测试了在15纳米AuNP的背景下检测75纳米AuNP。图a显示了从三组样本中获得的代表性PNB信号轨迹，包括15 nm和75 nm AuNP及其混合物。在混合样品中观察到的PNB信号的强度变化很大。实验结果与理论预测之间的一致性表明，这种方法可以从小颗粒的强背景（即1/240）中准确、绝对地量化大颗粒。重要的是，DIAMOND在无需额外分离步骤的情况下检测异质性的能力可能作为NPs的分析工具具有潜在意义，需要进一步研究。

DIAMOND允许表征异质NP悬浮液。图片来源：Nature communications

最后，研究团队应用DIAMOND快速检测呼吸道合胞病毒（RSV）。呼吸道合胞病毒是主要的呼吸道病原体，2015年全球5岁以下儿童死亡人数高达74500人。选择Synagis（Palivizumab）作为检测抗体，并将其偶联在AuNP上。AuNP-Synagis探针在室温下特异性识别RSV表面上的融合蛋白（图a）。图b显示了靶向不同形态RSV的AuNP探针的TEM图像（以红色突出显示）。图c显示了不同呼吸道病毒的检测，包括副流感病毒（PIV）、流感病毒A（IVA）、人类偏肺病毒（hMPV）和纯化RSV。结果表明，使用AuNP探针检测RSV具有良好的特异性，检测限为3.6×104pfu/mL。将DIAMOND检测、免疫测定结果与市售LFIA试剂盒（BinaxNOW，Abbott）进行了对比，结果显示，DIAMOND的灵敏度比均相免疫分析结果提高了约333倍，比商业LFIA提高了约150倍。

DIAMOND一步法均相免疫检测呼吸道合胞病毒。图片来源：Nature communications

为了进一步证明潜在的临床应用，研究团队应用DIAMOND检测鼻拭子样本中的RSV。结果表明，改良的探针能够敏感检测鼻拭子样本中的spiked RSV，检测限为102 PFU/mL。综上所述，在均质免疫分析上实施DIAMOND可以对人类样本基质中的病毒样本进行敏感分析，并支持潜在的临床应用。为了将DIAMOND与其他最先进的方法进行比较，研究团队使用数字环路介导等温放大（dLAMP）进行了比较。结果表明，dLAMP的LOD约为200 PFU/mL，类似于DIAMOND。此外，参考校准曲线，100 PFU/mL相当于1拷贝/μL RNA。换句话说，DIAMOND具有与核酸扩增方法近似的单分子检测能力的LOD。

研究团队开发了用于通过基于AuNPs的均质免疫分析检测病毒的DIAMOND。DIAMOND允许单个NP检测，并从异质群体中识别大颗粒。这种能力使DIAMOND能够在无需样品清洗的情况下进行均质分析。重要的是，DIAMOND可以特异性检测不同呼吸道病毒之间的RSV，并达到约100 PFU/mL（或1 RNA拷贝/μL）的检测限。与其他数字分析相比，DIAMOND以无隔间的方式计数事件，并利用one-pot protocol在室温下处理样品。DIAMOND研究为完整病毒的早期快速、超灵敏诊断提供了一个数字计数平台。

数字免疫分析为下一代诊断平台创造了高标准，例如无校准定量和早期诊断生物标记物的单分子检测。其广泛使用的主要障碍是耗时的检测步骤和实验室基础设施。在这里，研究团队开发了DIAMOND来克服其中的一些瓶颈。具体来说，DIAMOND使用均质免疫分析形式，不需要额外的样品清洗、分离和信号放大步骤。另一方面，DIAMOND不需要芯片制备或反应，需要更少的分析时间。此外，DIAMOND可以检测完整的病毒，而无需额外的液体处理（即病毒提取、热培养和芯片装载），因此在室温下提供了一种简化的诊断方法。