基于磁力富集技术的血浆细菌污染检测

血液制品的细菌污染是输血医学中的一个主要问题。尤其是，输注受污染的血小板（PLT）可能会导至严重的感染和败血症反应。PLT在室温（持续搅拌）下储存5天；因此，细菌可以很容易地从低水平（<1 CFU/毫升）繁殖到高滴度（<10 8 CFU/毫升）。美国食品和药物管理局（FDA）报告称，从2001年到2016年，输血受污染的血小板导至51人死亡。欧盟委员会报告称，2010年至2013年，欧盟有43例输血受到污染；36个涉及PLT污染。虽然只有少数病例，但发病率和死亡率都很高。

为了降低死亡率，需要准确、快速的细菌检测。检测的金标准是血液培养，这是最古老的临床技术之一。然而，细菌生长到可检测的水平通常需要24小时到几天。此外，当使用自动血培养系统时，低细菌滴度和缓慢的细菌生长可能导至假阴性结果。因此，人们致力于快速、灵敏地检测血液中的细菌病原体。强化细菌检测（eBDS）系统通过测量24小时内氧气浓度的下降间接检测细菌，但无法检测厌氧细菌。血小板泛属检测（Pan-Genera Detection）是一种侧向免疫分析方法，在30分钟内分别检测需氧和厌氧革兰氏阳性和阴性细菌中的脂磷壁酸（LTA）和脂多糖（LPS），然而，灵敏度较低（约10^4 CFU/mL），假阳性率较高。

通过聚合酶链反应（PCR）进行核酸（NA）扩增，可灵敏、特异地检测细菌病原体。然而，在PLT生产当天，PCR敏感性不高，因为细菌载量非常低。。此外，PLT含有许多干扰核酸扩增的物质（如免疫球蛋白G）。因此，富集细菌并制备纯化的细菌DNA对于准确、快速检测至关重要。抗体结合磁性纳米粒（Ab-MNBs）的免疫磁性分离（IMS）被广泛应用于分离病原体，从而消除抑制性物质。然而，Ab-MNBs并不能检测出所有引起败血症的细菌；该抗体对1种细菌有特异性，但至少有10种细菌会引起败血症。因此，MNB必须与结合广谱细菌的材料结合。

近日，来自韩国的研究团队在杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Molecular detection of bacterial contamination in plasma using magnetic-based enrichment”的文章，在文章中，研究团队开发了一种方法，实时聚合酶链反应（PCR）来检测使用抗生素结合的磁性纳米珠（MNB）富集的革兰氏阳性和阴性细菌。MNB涂有聚乙二醇（PEG），以防止血液成分聚集。超过80%的细菌被MNB捕获，革兰氏阳性和阴性细菌的检测水平分别为10 CFU/mL和100 CFU/mL。这种方法仅需使用少量血液成分，检测时间<3小时。因此，与传统方法相比，使用MNB的实时PCR允许仅使用少量血液成分进行高灵敏度的快速检测。

图片来源：Scientific reports

带有PEG涂层的抗生素结合MNB的合成如图a和b所示。首先，合成平均直径为150 nm的Fe3O4纳米珠，用PEG涂层，并与vancomycin或allantoin连接，以得到MNBs@PEG-Van和MNBs@PEG-Al。（图c）MNB具有典型的核壳结构，即直径150 nm的Fe3O4核和5.5 nm厚的PEG涂层。

材料与MNB（磁性纳米珠）的结合。

图片来源：Scientific reports

如图a所示MNBs@PEG-Al对在磷酸盐缓冲液（PBS）和单采血浆中添加的大肠杆菌捕获效率分别为90%和80.1%。MNBs@PEG-Van对PBS和单采血浆中金黄色葡萄球菌的捕获效率分别为92.3%和82.1%（图b）。

MNBs富集大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的效率。

图片来源：Scientific reports

从富集的革兰氏阴性菌和阳性菌中提取DNA并进行实时PCR。如图a所示，在样本培养12小时后检测到102 CFU/mL的大肠杆菌，而图b所示，未被MNB捕获的大肠杆菌仅在10 4 CFU/mL下检测到。如图c所示，在未事先进行样本培养的情况下检测到103 CFU/mL的大肠杆菌，但从101到102 CFU/mL提取的DNA无法扩增。图d显示，当比较含大肠杆菌的单采血浆在104 CFU/mL水平下被MNB捕获（Ct；30.54±0.48）和未捕获（Ct；31.95±0.95）时，Ct值的差异约为1.4，而MNBs@PEG-Al在10 3 CFU/mL的水平下有效捕获了细菌。

大肠杆菌实时PCR检测结果。

图片来源：Scientific reports

如图a所示，在样本培养12小时后，检测到101 CFU/mL的金黄色葡萄球菌。图b显示，未被MNB捕获的金黄色葡萄球菌仅在10 4 CFU/mL时被检测到。在未事先进行样本培养的情况下检测到102 CFU/mL的金黄色葡萄球菌，但无法检测到从101 CFU/mL中提取的DNA（图c）。图d显示MNBs@PEG-Van在104 CFU/mL的水平上有效捕获了细菌。

金黄色葡萄球菌实时PCR检测结果。

图片来源：Scientific reports

当PLT在RT下搅拌储存5天时，即使初始悬浮液中的CFU含量<1 CFU/mL，细菌也会增殖。目前的培养方法培养需要1-5天，数据只有在PLT出库后才可用。其次，需氧和厌氧细菌的培养都需要大量血液（>20毫升）。分子诊断需要小样本量（<1 mL）并在3小时内检测病原体。通过提高细菌富集度来缩短培养时间至关重要。MNB的这种富集需要它们在血液成分中分散，并且vancomycin和allantoin等受体与细菌病原体结合。血浆含有许多蛋白质、凝血因子和IgG；这些很容易吸附到未经PEG涂覆的MNB上。孵育20分钟后，MNB在血浆中聚集，但MNBs@PEG没有聚集。PEG阻止了MNB表面的非特异性结合。将MNB（4×10 9至4×10 12粒/毫升）添加到1毫升含有细菌病原体的单采血浆中。MNB与结合广泛细菌种类的受体结合。vancomycin与革兰氏阳性细菌的肽聚糖层的-Lys-D-Ala-D-Ala结合，同样也与vancomycin耐药细菌结合。革兰氏阴性菌外膜的LPS结构因细菌种类而异，但已知allantoin可以与大多数LPS结构结合，而与菌株无关。

根据当前的FDA指南，检测PLT细菌污染的标准方案基本上包括培养12小时。即使PLT细菌污染的病例较低，但这对于公共健康血液成分的安全验证至关重要。在提取核酸之前，通过MNB富集病原体可降低可能的抑制剂水平，因此，检测时间大大缩短（<15小时）。培养12小时后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的富集率均大于80%，检测到的浓度分别为101和102 CFU/mL。未经培养的检测水平分别为10 2和103 CFU/mL。因此，在样本培养12小时后，此方法的灵敏度至少是侧向层析分析试剂盒的100倍，例如血小板PGD试验（检测限=10 4–5 CFU/mL）。此外，这种方法只需要小样本量（<1 mL）来监测细菌污染。这也意味着无需考虑MNB对PLT的不利影响，因为未用于测试的剩余PLT将被输血。现在的目标是进一步提高灵敏度，并设计一个全自动的高通量系统，以方便临床应用。