实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR，Q-PCR) 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
Q-PCR技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃，它除了具有PCR的高灵敏性外，还具有可直接监测扩增中的荧光信号变化获得定量结果，精确性高；定量和扩增同步进行，克服了PCR的平台效应；特异性和可靠性更强；能实现多重反应；无污染性；具实时性和可靠性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究领域和医学研究等领域。 扩增曲线（amplification curve）: 是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号随着循环数变化而绘制的一条曲线。在进行PCR反应过程中，通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测，最后将荧光信号值通过成像技术显现在计算机上。正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。 基线（baseline）：是背景曲线的一段，在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大，接近一条直线。 荧光域值（ threshold ）：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是 PCR 反应前 3-15 个循环荧光信号标准偏差的 10 倍，即：threshold 。 阈值循环数（Ct值）：表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，Ct值越小；起始拷贝数越少，Ct值越大。利用已知起始拷贝数的标准品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标的一条标准曲线。只要获得未知模板的Ct值，即从标准曲线上计算出该模板的起始拷贝数。
二. Q-PCR方法简介 PCR按照采用的荧光材料的不同，基本可以被分为两大类：SYBR Green染料法和TaqMan探针法。 荧光染料嵌合法： SYBR Green是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料，其不会与单链DNA结合，且在游离状态下几乎无荧光。因此，SYBR Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。 荧光探针法： Taq-Man探针法是最经典的探针方法，其原理是利用扩增过程中Taq酶的 5’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针，探针5`端标记荧光报告基团（供体），3`端标记荧光淬灭基团（受体）并被磷酸化以防止探针在PCR过程中延伸，当引物延伸至寡核苷酸结合位置时，Taq酶可以将其切割成小片段，使报告基团和淬灭基团分开并发出荧光，经过检测伴随扩增产物增加过程中荧光强度的增长对样本进行定量分析。近年来对Taq-Man探针进行改良发展出TaqMan-MGB探针，在Taq-Man探针的3端加入一个能插入DNA小沟的二氢环化吲哚卟啉-三肽（DPI3），可以使大大提高探针的TM值，增加杂交反应的特异性。
从原理可以看出，荧光探针只与目的序列结合，理论上探针法的荧光信号只来源于目的序列，即不受非特异性产物的影响，因此，TaqMan探针法的特异性更高，定量更准确。
在基因治疗产品临床前及临床评价中，生物分布是必不可少且极为重要的一部分，该研究的目的是寻找药物进入人体后在靶组织及非靶组织的分布、存续和清除情况。由于还缺乏针对基因治疗药物的生物分析方法学验证的相关指导原则，目前对于该类生物分析方法的验证均是从科学性的角度出发并基于研究目的而开展的一些验证工作。 1、研发阶段 （1）引物的设计：针对特定靶标设计相应的引物，验证引物特异性，包括引物产物特异性和种属特异性。引物设计需注意以下几点： （3）扩增体系： ① 模板浓度与纯度：模板的初始浓度越低，结果的重复性越差。初始浓度越高，超出了反应体系的线性范围，则需要对模板进行稀释，否则随着底物的过早耗尽，可能出现假阴性结果。如果待测模板的浓度处于PCR反应体系的最低检出限附近，则需要检测双份以保证结果的可靠性
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