开发｜补充诊断和伴随诊断免疫组化检测具体考虑因素

卫生部门通常认为，伴随诊断和补充诊断的区别在于，测定结果对于决定用相应的药物治疗患者是至关重要的（辅助），还是仅仅为决定提供参考（补充）。

在实践中，FDA批准的具有配套诊断（CDx）IVD的药物的标签将规定，IVD是药物安全和有效使用的必要条件，患者必须从测试中得到特定的结果才有资格使用该药物治疗。

另一方面，FDA批准的具有补充诊断IVD的药物标签将建议使用该测试来评估该药物对特定患者的潜在益处和风险，但不会根据测试结果来限制药物的使用。

补充诊断IVDs用于获得可能改善疾病管理、患者风险分层以及与相关治疗药物相关的药物监测的信息。

c/CDx IHC测定是为临床使用而确认的，并被监管机构视为具有严格定义的组成部分的综合、固定系统。这些组成部分包括试剂、染色方案（即试剂应用的顺序、持续时间和温度）、样本类型、分析前程序、产品标签以及临床确认期间使用的任何培训或参考材料。

如果IVD打算与自动IHC染色机一起使用，那么特定的染色机型号和软件也成为系统的一部分，染色程序软件将被锁定以防止更改。对产品包装中描述的既定系统组件或参数的任何改变都将被视为偏离该测定的批准用途，从而使测试结果无效。

一个典型的自动化c/CDx IHC检测系统的示例组件包括（如适用）：

➤  抗原修复程序；

➤  主要抗体克隆和滴度；

➤  检测系统；

➤  阴性对照试剂；

➤  组织控制；

➤  解释（打分）算法；

➤  自动IHC染色机模型；

➤  锁定软件染色程序；

➤  包装内页；

➤  解释指南；

➤  其他培训材料，以及

➤  幻灯片图像库。

2.1、计分算法

c/CDx IHC测定的评分和解释方法必须得到严格的开发和确认。计分算法通常规定染色的阈值水平，超过或低于该阈值，受益或风险的可能性就大或小，并规定量化染色水平的方法。

单一阈值的算法提供了二元的阳性/阴性结果，而多阈值的算法则提供了生物标志物表达的离散评分等级，可能与临床获益或风险水平相关。在c/CDx IHC测定的开发过程中，对各种算法选项进行了研究，目的是确定一种能使测试的灵敏度、特异度和再现性最大化的算法。

c/CDx测定的算法开发始于对其在感兴趣的特定组织和疾病状态下的染色的显微镜检查。通过分析染色的定位、强度和频率，并考虑到生物标志物的已知生理特征，测定开发团队可以提出一个或多个可能与治疗效果或风险有关的诊断阈值。

作为算法开发过程的一部分，病理学家经常使用H-scores（histoscore）方法，该方法将染色强度和频率结合为一个半定量的指标。在这种方法中，强度被量化为0（无染色）、1+（弱染色）、2+（中度染色）或3+（强染色），频率被量化为相关细胞（如有活力的肿瘤细胞）在适当的亚细胞位置表现出染色的百分比。然后，根据每个强度级别的染色细胞的百分比来计算H-scores：

H-score = 1（%细胞染色强度为1+）+2（%细胞染色强度为2+）+3（%细胞染色强度为3+）

尽管H-scores在测定开发过程中对假设测试很有用，但它们是模糊的，因为不同的染**况可以产生相同的H-score。此外，它们是复杂的和主观的，使得它们在常规临床实践中的使用不实际。

理想情况下，评分算法是在患者结果数据的背景下开发的，这些数据可以被分析以建议一个特定的预测阈值。然而，来自治疗性试验的患者结果数据往往是不可用的，或者在测定发展的早期阶段是不成熟的。

因此，评分算法的选择往往基于初步的临床数据、已知的生物标志物流行率和生理表达范围，以及不同生物标志物表达水平的预期疗效。

2.2、选择一阶抗体的滴度

用于Ⅰ类测定的一阶抗体通常以最高的活力浓度使用，而用于Ⅱ类或Ⅲ类测定的Abs则以更适中的浓度使用，以提供弱或中等强度的特异度染色或接近诊断阈值的强度。

2.3、组织对照的选择

在c/CDx测定中正确使用组织对照对于测定的一致性和患者的安全性至关重要。

导至相关药物使用不当的假阳性c/CDx结果可能会使患者遭受有害的副作用，而没有合理的获益可能性，假阴性结果可能会导至患者被错误地拒绝使用潜在的有益药物。

为了最大限度地提高c/CDx IHC测定的诊断灵敏度，阳性对照组织的选择应与阈值表达强度相近。如果测定评分算法需要评估多种类型的细胞成分，如用于程序性死亡配体-1（PD-L1）评分的一些算法，组织对照也必须包括这些成分。如果没有一个组织能提供所需的多种细胞成分，可能需要两个或更多的外部对照。

对于为使用FFPE组织而开发和确认的c/CDx IHC测定，使用细胞系作为外部对照是不合适的，因为细胞系将不会受到与测试组织相同的分析前条件的影响。然而，细胞系包含在一些c/CDx试剂盒中，以提供判断生物标志物染色一致性的手段，它们经常被用于临床确认前的可行性和验证研究。

2.4、使用阴性对照试剂

即使CAP不再强制要求在非AVB/LSAB测定中使用NRCs，卫生监管机构通常要求NRCs作为批准的c/CDx测定的一部分。与组织对照一样，在评估任何患者样本之前，必须确认NRC玻片在c/CDx测定中的正确染色。

除了开发和确认c/CDx IHC测定的技术方面，测定的开发者还必须制定病理学家培训计划，以确保在常规临床环境中安全和有效地使用测定。

传统上，这种培训是由病理学家使用精心策划的玻璃幻灯片进行面对面的培训，并提供实时反馈。这种培训方式的实际局限性导至了基于互联网的互动式自我培训项目的发展，其中使用虚拟显微镜界面查看整个幻灯片图像，模仿传统显微镜的体验。

初步数据表明，数字培训的效果可与传统的使用玻璃切片的当面培训相媲美，甚至对复杂的CDx测定也是如此。

无论基础技术如何，培训计划必须考虑到c/CDx评分算法的固有复杂性。例如，最简单的解释算法是二进制的（即，结果要么是阳性，要么是阴性），通常需要一个不那么全面的培训项目，而半定量的算法则是根据多个染色阈值分配治疗效果的可能性，或者要求病理学家对两种程度的染色（如0.5% vs 1%）进行精细区分。