技术｜探针的设计标准

探针需要与一个互补的靶点序列进行唯一杂交。探针所针对的序列取决于（诊断）问题。例如，需要检测的是什么，为什么，检测的结果意味着什么？是基因组DNA、mRNA或rRNA还是具有诊断作用的miRNA之一？探针的大小和类型以及相应的杂交方法都存在很大的差异。

每种变体都是可能的；双链和单链的DNA或RNA探针，可以与DNA或RNA杂交。这意味着DNA:DNA、DNA:RNA或RNA:RNA的组合可能发生。根据GC比率的不同，形成稳定的杂交体所需的最小长度是13 ~ 20个核苷酸。

理论上，没有设定最大长度；有时，大于400个碱基的探针会被分解（图1）。

图1 | 杂交和杂交探针检测的命名法

一些表型的示意性概述：

➤  寡头探针，在化学合成过程中进行标记，通常用于不同的独特探针的混合；

➤  片段探针，通过重组DNA技术或PCR测定产生，通过酶技术进行末端标记；

➤  总探针，通过重组DNA技术生产，通过随机引物或切口平移标记。

一般来说，反应条件要根据每个特定的探针-靶点组合以及反应发生的基质来调整。需要在大小、核苷酸序列和靶点浓度，以及产生足够信号所需的探针量之间取得平衡。

探针的杂交能力描述了探针与靶点结合的能量。简而言之，两个互补的（多/寡）核苷酸链内和之间的所有非共价相互作用的总和表示为ΔG（吉布斯自由能），单位为kcal/mol。这个数值越负，探针与靶点的结合就越强。正值表示需要添加能量，不会自发发生反应。

促进探针杂交能力的因素是探针的G/C含量和大小。富含A/T的寡头探针将更容易从其靶点上解离。最好是探针的G/C含量与靶点序列周围的区域相似，特别是在基于探针的PCR中。

如前所述，对探针的最大长度没有限制。在分子诊断中，探针用于识别原始或纯化的样品、细胞或组织样品中的靶点DNA，无论是否在扩增靶点（s）之后。用于PCR的探针的正常长度约为15-30bp。

如果在PCR反应中使用，这些探针通过杂交确认扩增物的存在（图2、图3、图4和图5）。

图2 | 从PCR中捕获标记扩增产物的两种方法

a 基于互补序列，标记的扩增物将被固定在固相（如玻璃或尼龙膜）上的探针捕获。除非标签是荧光色素，否则将使用判读器进行检测。

b 生物素化的PCR产物与序列特异性标记的PCR产物一起被捕获在固相上，用链霉亲和素涂布，捕获后用报告基团检测

图3 | 用水解探针猝灭

一旦带有分离核苷酸的荧光标签在自由溶液中释放，就会开始发出荧光。猝灭剂也处于隔离状态，但与荧光色素的距离太大，无法猝灭荧光

a 5′-氟色素（F）、MGB（三肽）、猝灭剂（Q）和间隔物的分子组织都在寡聚物的3′端。图3.23b中概述了连接体。

b 连接在连接体上的荧光色素（F）的分子组织，通过在寡核苷酸的5′端加入胞嘧啶-dUTP。

c 实时PCR中5′-核酸酶活性的原理。靶点变性后，引物和水解探针都会与其中一条DNA链杂交。探针的设计方式是使其比引物更快速有效地杂交。探针必须对扩增物有很高的特异性。探针的位置在靶点的5′端附近。水解探针在溶液中，由于附着在探针上的非荧光猝灭剂（Q）的猝灭作用，不会自动发亮。一旦寡头与靶点序列完全退火，DNA的合成就从引物（和探针）的3′端开始。当酶遇到水解探针时，聚合酶的5′-3′-外切酶域将变得活跃，并逐个碱基地去除探针。在这个过程中，DNA的合成继续进行。

图4 | 分子信标

分子信标的主要结构和示意图显示了荧光剂（F：EDANS）和猝灭剂（Q：DABCYL）。

a 分子信标的例子。分子的3′和5′侧的垂直线表示互补发夹区。

b 经典的分子信标。间隔物在寡头的5′或3′端一侧耦合，另一侧是荧光染料（F）或猝灭剂（Q）。间隔物由一定长度的碳水化合物组成，以获得彼此之间的紧密接触，达到最佳的猝灭效果。

c 分子信标的示意性概述。用于靶点杂交的互补碱基形成一个环形结构（发夹）。

d 带有额外核苷酸间隔物的荧光色素的位置概述，以改变FAM或TAMRA与BHQ猝灭剂的位置。

图5 | 双探针杂交（特定化学反应）

用引物和头对尾的探针杂交的扩增物示意图（锚式杂交）。

特别是，实时PCR的引入导至了水解探针、「双」探针和分子信标的大规模使用，成为确认扩增物身份的重要工具。这尤其适用于微生物学和突变测定研究。

适用于筛选DNA数据库和染色体分析的探针可能有数千个核苷酸长。几乎在所有情况下，碱基序列都需要知道。然而，「全染色体」杂交、SNP阵列或比较染色体杂交（CGH）则不需要（见图6）。当序列已知时，探针的设计与引物的设计是相同的。

图6 | ULS标记