无需修饰引物，LAMP产物标记新方法！适用于多种下游应用

环介导等温扩增（LAMP）是最著名和最流行的等温扩增方法之一。它的简单性和速度使该方法特别适合于护理点诊断。然而，假阳性结果仍然是一个主要缺点。许多（下游）应用用于检测LAMP扩增子，如比色分析、原位LAMP或CRISPR Cas系统。通常，对于不同的检测应用，如横向流动分析，需要对LAMP产品进行修改。这通常是通过事先修饰引物实现的。

近日，来自德国的研究团队在Scientific reports上发表了一篇题为“Investigation and validation

of labelling loop mediated isothermal amplification (LAMP) products with different nucleotide modifications for various downstream analysis”的文章，研究的目的是评估不同修饰核苷酸（如Cy5-dUTP、生物素-dUTP和aminoallyl-dUTP）的扩增子标记作为预标记引物的替代方案。研究团队研究了分子大小、核苷酸量以及靶浓度对扩增和标记效率的影响。这项研究表明，在LAMP过程中，使用不同的修饰核苷酸可以实现LAMP扩增子的不同标记，并且这些样品可以通过荧光光谱、凝胶电泳、微阵列和横向流动系统等广泛的下游应用进行分析。此外，研究团队还证明了基于微阵列的检测以及识别和区分假阳性的能力。

图片来源：Scientific reports

2000年，Notomi等人开发了一种新的等温扩增技术，名为环介导等温扩增（LAMP）。二十多年后，LAMP属于最流行的等温放大技术。该方法基于一组多达6个引物和一个链置换聚合酶，能够高度敏感和特异地扩增少量目标DNA。结合逆转录酶，它也适用于RNA扩增（RT-LAMP）。到目前为止，在RT-LAMP、RIME-LAMP或DARQ-LAMP等多个变体版本中，可以找到超过千份使用该技术的出版物。自2019冠状病毒疾病大流行开始以来，已经发表了800多篇关于SARS-CoV-2检测的出版物。其中，大约有100个是用LAMP作为检测方法的。这不仅强调了LAMP对一般研究的重要性，也强调了它对当前全球重要问题的重要性。

与基于PCR的非等温方法相比，使用LAMP进行核酸扩增和检测具有许多优势。首先是放大速度。通过使用合适的引物组和最佳扩增条件，可以在不到30分钟的时间内检测到少量目标核酸，而PCR过程的扩增时间最多为3小时。此外，由于对能源和技术设备的需求减少，护理点设备中集成和使用LAMP是非常方便的。尽管LAMP有许多优点，但由于污染、序列相似性和引物二聚体引起的扩增假阳性是众所周知的LAMP缺点。

LAMP与下游分析系统结合检测扩增产物的方法很广泛。包括标准凝胶电泳和定量扩增LAMP（qLAMP），通过不同的比色试剂（酚红、无色结晶紫、SYBR绿、孔雀石绿）进行横向流动分析（LFA）或与CRISPR-Cas系统的组合。最常用的是LFA和比色分析，但上述技术的主要局限性在于，它们不适合区分假阳性结果。基于微阵列的检测方法有助于克服这一障碍。

长度约为20–30 nt的特异性单链DNA探针固定在修饰表面上。扩增后，产物可以在这些探针上进行高度特异性杂交。通过选择合适的探针，不仅可以将扩增子与假阳性区分开来，甚至可以将其与单核苷酸多态性（SNPs）区分开来。

使用（半）定量分析系统（如qLAMP）和基于横向流动的方法需要标记用于目标检测的扩增子。到目前为止，使用预先标记的引物或探针一直是首选方法。这也导至了低灵活性和高成本、信号强度或放大效率调整不灵活性。或者，可以在扩增过程中使用预先标记的核苷酸进行靶向标记。这些类型的核苷酸具有不同的修饰，例如荧光团、生物素或氨基功能化，用于随后的定制标记。

本研究旨在分析和评估所述基于直接和灵活的LAMP标记方法。此外，还证明了用3-Cy5-dUTP、生物素-dUTP和AA-dUTP标记LAMP扩增子的优缺点，代表了小、中、大尺寸的核苷酸修饰。

上述核苷酸修饰不仅具有不同的分子大小，而且在不同的分析和检测系统中也有用。Cy5-dUTP可用于用荧光团直接标记扩增子，用于多种荧光检测方法，结合生物素dUTP可在常用LFA中的链霉亲和素修饰表面上实现非共价固定。AA dUTP被认为允许加入一个功能基团，这可能有助于后续NHS分子的标记。

LAMP-dUTP标签策略及应用。

图片来源：Scientific reports

为了确定在LAMP期间使用标记核苷酸对扩增效率的影响，使用不同量的SARS-CoV-2 cDNA和Cy5-dUTP以及生物素-dUTP和AA-dUTP稀释系列进行了基于SYBR绿色的定量环介导等温扩增（qLAMP）。每个反应的cDNA量为4.2E+00ng，Cy5-dUTP浓度范围为4.0E-03mM到2.0E-01mM，在不到5分钟的时间内检测到目标DNA。使用该量的靶DNA的反应效率只有轻微差异。然而，当使用较低数量的靶DNA时，已观察到扩增效率降低。

标记核苷酸对扩增效率的影响。

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与未标记的核苷酸相比，Cy5-dUTP是一个相对较大的分子，因此研究团队研究了使用不同分子大小的各种dUTP标签对扩增效率的影响。对于AA-dUTP（589.2 g/mol）、生物素-dUTP（862.7 g/mol）和Cy5-dUTP（1387.3 g/mol），在以分子量表示的分子大小和所需的扩增时间之间发现了明显的相关性。未标记的参考样品的Ct值为15.6分钟。使用生物素dUTP和AA dUTP标记也会导至Ct值小于16.5分钟。使用Cy5 dUTP对扩增时间的影响最大，Ct值偏移为3.5分钟。

分子大小和浓度的影响。图片来源：Scientific reports

通过Cy5-dUTP直接标记和AA-dUTP间接标记以及随后的NHS-Cy5标记，计算Cy5掺入LAMP扩增子的速率。LAMP扩增产物通过荧光光谱分析，记录在630nm激发下600 nm至800 nm范围内的发射光谱（图4A）。所有样品（Cy5稀释系列、no-Cy5阳性对照、纯水和无酶对照）均显示一个尖峰，最大强度为630nm，只有含有Cy5的LAMP样品显示出第二个更宽的峰值，最大荧光值为663–665 nm。

在游离Cy5 dUTP标准校准线的帮助下，计算纯化LAMP扩增产物中测得的荧光团。计算得出通过LAMP反应使用4.0E-03 mM Cy5d dUTP确定每100个未标记dTTP的Cy5 dUTP掺入率为0.05，12.5%标记dUTP/87.5%未标记dTTP的掺入率确定为1.70。当使用2.0E-01 mM AA dUTP进行LAMP时，100个可能位置中约有1.9个AA-dUTP被纳入。

LAMP扩增子中Cy5 dUTP的检测。

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沙门氏菌标准LAMP检测的扩增时间<40分钟。然而，当使用60分钟强制假阳性（这是LAMP的一个常见缺点）时，在大肠杆菌对照组和无模板对照组（NTC）中观察到假阳性。Cy5 dUTP LAMP和随后的微阵列分析相结合，以区分沙门氏菌扩增和假阳性。用特异性酶（RsaI）和非特异性核酸内切酶（DNase）处理LAMP产物产生的片段大多小于100 bp。用沙门氏菌特异性探针杂交处理和未处理样品后，研究团队可以在假彩色图像中看到信号强度的明显差异。经酶处理和未经处理的对照组（NTC和大肠杆菌）以及经处理的沙门氏菌样品显示的荧光强度仅略高于背景。另一方面，未经处理的沙门氏菌LAMP扩增产物产生的信号强度明显不同于背景和对照组。

基于微阵列的Cy5-dUTP标记假阳性鉴别。

图片来源：Scientific reports

为广泛的不同应用修改LAMP 产物是一种常用技术，通常通过加入预修饰的引物来实现。由于多达六个引物，LAMP引物的设计和评估不像PCR引物的设计那么简单，如果不仔细验证，可能会导至假阳性结果。结果表明使用较小的分子（例如AA-dUTP与Cy5-dUTP相比）可以提高扩增效率，但似乎对标记效率没有显著影响。LAMP酶的活性受分子大小的影响很大，但取代率仅受轻微影响。因此，只要具有所需修饰的标记核苷酸可用，直接标记就更合理。这消除了后处理步骤，如偶联反应和产品纯化。

微阵列检测是分析PCR和等温扩增产物的常用且有价值的工具。LAMP扩增可以直接与微阵列检测相结合来分析和区分扩增子。此外，通过在LAMP反应后添加杂交缓冲液并在阵列上孵育，无需纯化即可实现。这项工作结果表明，使用含有1–2%标记核苷酸的x-dUTP标记LAMP产品可产生良好的信号。与之前公布的标记方法相比，没有显著的扩增或分析性能损失。迄今为止的结果表明，基于横向流动、基于微阵列和光谱分析的分析性能相当。此外，该方法可通过增加标记分子的掺入率来优化灵敏度，且结合微阵列技术等合适的检测方法，应该可以进行多重LAMP分析，而无需使用大量标记的引物。

总之，在扩增过程中直接加入不同的修饰核苷酸，可以定制和灵活地标记LAMP扩增子。证明了一种易于使用且灵活的替代常用的基于引物的标记的方法，该方法能够根据实验问题更灵活地调整标记效率。这使得无需预先标记引物即可轻松适应不同的下游检测方法，如荧光光谱法、凝胶电泳、微阵列、横向流动系统或原位LAMP。