简单低成本！纳米孔靶向测序检测基因组结构变异

关于纳米孔靶向测序的应用领域越来越多，覆盖面越来越广，最终能发展到什么程度和高度呢，大家来议一议吧。

基因组结构变异（SVs）与复杂的多因素疾病有关。SVs的发现因其大小的变化（从50个bps到几个Mbs）和分类的多样性（删除、插入、易位、翻转和拷贝数变化）而变得复杂。这些因素严重限制了SV检测单一技术或方法的使用。例如，短读高通量测序技术被广泛用于研究和解决较小的SV。它们非常准确，但短读不太适合长而复杂的SV表征。最近的长读取测序技术的优点是，在检测大型SV时读取长度更长，但吞吐量低，错误率高，成本高昂。

单分子光学图谱SV检测技术，其原始分子长度平均为300 kbp，能够实现更便宜、更快的SV表征，并被广泛用于创建长程SV图谱和包括重复在内的复杂重排。但它缺乏序列级分辨率，并且仅使用光学图谱，不可能精确定位SV断点。

为了全面执行SV发现和分析，越来越多地采用多平台和计算方法相结合的方法。这些方法最大限度地实现了单体型SV解析和罕见SV表征，但成本高昂、资源密集，并增加了数据分析的复杂性，限制其在常规SV特征或大规模研究中的采用，限制了SV发现、验证和基因分型。因此，需要多平台方法来绕过前面提到的任何单一基因组分析技术的技术限制。在SV断点发现后，使用下一代测序广泛而准确地描述SVs的特征，用于断点检测、基因分型、SNP检测或拷贝数变异，更为经济。

已经发表了一些报告，其中使用光学图谱来检测SVs（1kbp到几Mbp）。尽管缺乏SV断点的精确位置和序列信息，但通过光学图谱获得的SV区域随后可用于靶向测序。另一方面，还报道了几种用于SVs验证和基因分型的靶向测序方法。近日，来自美国的研究团队在Scientific reports杂志上发表了一篇题为“Multiplex structural variant detection by whole‑genome mapping and nanopore sequencing”的文章，在这篇文章中，研究团队提出了一种结合光学图谱定位和cas9辅助的靶向长读测序的SV分型方法。在本文中，研究团队展示了通过此方法解决了通过光学图谱检测到的14种不同SV断点，精确定位了六个删除、七个插入和一个翻转的断点。研究团队通用且灵活的方法可以有效且经济地针对一个或多个样本中的多个位点。相关分析的简单性有助于加速SV发现和常规诊断和关联研究的分型筛查。

图片来源：Scientific reports

高通量光学图谱创建了一个基于基序标签的全基因组图谱。基于标签之间的间距、标签增益或标签丢失，检测SVs（删除、翻转、插入、易位、阵列扩展/收缩、重复和易位）。研究团队生成了DLE标记的全基因组组装，并在NA12878中检测到2280个2 kbp或更长的SV，包括1265个插入、759个缺失和256个翻转。然而，全基因组作图无法精确定位确切的断点，这对于诊断和目标关联研究非常重要。由于只有SV的一个子集可能会影响生物学，研究团队设计了一种策略，依靠全基因组光学作图来发现SV，并通过纳米孔测序（nanopore sequencing）来解析特定的SV位点来定位确切的断点。

在概念验证实验中，研究团队设计了一组sgRNA靶向五个缺失、五个插入，以及一个翻转，用cas9辅助靶向纳米孔测序来验证和定位断点。对于每个SV，研究团队设计了一个独特的gRNA对，用于cas9介导的靶向裂解反应。合成了一个用于所有缺失和插入的单一sgRNA混合物，并将其用于单管cas9裂解反应以生成目标片段。裂解反应后，在单个纳米孔探针上扩增并测序所有靶点。

为了有效地生成11个目标片段，这是整个基因组的一小部分（~0.03%），研究团队优化了方案以抑制非目标片段。如图所示，执行了两个blocking步骤。DNA片段显示为黑色条带，目标位点显示为橙色条带，设计的gRNA位点显示为红色箭头。在第一个阻断步骤中，通过加入双脱氧核苷酸阻断内部缺口和断裂位点的3′端。在随后的步骤中，内部缺口和断裂部位的5′端也被去磷酸化阻断，以阻止非特异性adapter连接。将adapter连接的片段进行PCR扩增、纯化，然后在nanopore flongle上测序，在靶位点产生17×的中位覆盖率。使用这种方法，研究团队在碱基水平上精确地检测到了五次删除、五次插入和一次翻转的断点。

cas9辅助靶向纳米孔测序工作流程示意图

图片来源：Scientific reports

Deletion的测序结果如图所示。这是通过光学图谱检测到的45504427和45517614之间12号染色体上13.2kbp的杂合缺失。单倍型1的重叠群与hg38参考具有相同的模式，没有检测到缺失；在单倍型2（用水平黑条标记）的重叠群上，检测到在45504427到45517614 bp之间缺失13.2kbp。hg38上的几个基序在单倍型2重叠群中缺失。

为了区分这种杂合缺失，研究团队设计了三个gRNA，作为两对。第一对用两个箭头（蓝色和黄色）表示。该单倍型上的gRNA对设计用于产生与hg38长度相同的3.5kbp片段（用棕色条表示）进行测序。对于包含单倍型2的缺失，45507940bp处的gRNA_1（蓝色箭头）与45518921bp处的gRNA_3（红色箭头）一起使用。gRNA对在hg38上相距约11kbp，跨越在hg38上检测到的整个缺失长度（黑条），并延伸到已知的缺失侧翼区域。cas9切割后，gRNA对会生成长度未知的较短片段，但至少包含一部分缺失侧翼序列和缺失断点。

研究团队观察到两组读数，一组读数，3.5kbp长，在45507952和45511479bp之间匹配，两侧为gRNA_1和gRNA_2，与预期片段长度匹配。这些读数证实存在无删除的单倍型。第二组读数约为5.5 kbp，在45507952–45518937 bp之间对齐。对齐的读数不连续，部分分别在5'端和3'端对齐，中间有间隙（黑色箭头）。中间的黑色箭头是用45509371 bp的断点检测到的真实删除序列。显然，此测序结果验证了研究团队的方法，并检测到杂合缺失。

cas9辅助靶向纳米孔测序方法解析杂合缺失。

图片来源：Scientific reports

研究团队还在同一反应中靶向了多个lone interspersed nuclear elements（LINE-1）插入。图3显示了一个示例的光学图谱数据，即33854180和33867084 bp之间的12号染色体纯合插入。预计的插入区域用黑条标记，在重叠组上跨越约12.9 kbp，该插入被怀疑是LINE-1插入。

为了测序这个断点，研究团队设计了两个gRNA来定位它；hg38上的gRNA_1（蓝色箭头）预计将在33854858 bp处切割。另一个gRNA（gRNA_2，红色箭头）预计在LINE-1插入中切割。gRNA对有望产生约15kbp长度的片段，包括部分插入侧翼序列（棕色条）、断点和部分插入序列（粉色条）。正如预期的那样，发现该SV区域的读数从gRNA_1切割位点开始匹配，并延伸至插入区域。从gRNA_1切割位点（33864471 bp）开始，与hg38匹配的测序读数长度为8.8kbp，观察到有两段由棕色条和粉色条表示。棕色条下的序列在33864471–33864402 bp之间与hg38对齐，而粉色条下的序列与hg38不对齐。但粉色片段与假定的LINE-1完全匹配。

cas9辅助靶向纳米孔测序方法解析插入（insertion）。

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最后，研究团队应用此策略来解决染色体12上纯合翻转的断点。光学图谱显示，从17770250到17859681 bp的翻转大小为~90 kbp。为了测序这个翻转，设计了两个gRNA，其中一个位于翻转侧翼区域11176068 bp（gRNA_1，蓝色箭头），另一个位于翻转内部17857700 bp（gRNA_2，红色箭头）。由于样品中的翻转，预计gRNA_2将向5′端移动，更靠近gRNA_1，并产生约6.5 kbp的片段。预计片段具有一部分倒置区域（紫色条）和一部分倒置侧翼区域（黄色条）。与SV区匹配的6.5kbp长序列片段从17857721bp的gRNA_2到17864360bp的5′到3′方向对齐，由紫色条（17857721–17861570 bp）表示，然后是由黄色条（17861571–17864360 bp）表示的不能匹配部分。黄色条表示从hg38上的蓝色箭头开始沿5′到3′方向与翻转侧翼区域对齐的部分读数。同样的一组读数也可以看到在另一个断点附近从17772217bp以3′到5′方向与hg38对齐。这是由于从两个预测断点延伸到翻转的5kbp跨度内的高序列相似性。综上所述，研究团队检测到了该翻转的两个断点，第一个断点位于17768358 bp，第二个断点位于17861570 bp，绿色箭头所示。

cas9辅助靶向纳米孔测序方法解析翻转（inversion）。

图片来源：Scientific reports

SV检测面临着针对误报和技术限制的严格阈值。综合SV表征需要资源密集型多平台和计算方法。然而，所发现的SV中只有一部分具有生物学意义。只针对少数SV进行特征化将减轻经济和计算负担。为了有效地靶向和解析多种SV，研究团队在本文中提出了一种利用全基因组作图和cas9辅助靶向纳米孔测序的简单策略。

通过结合光学图谱和cas9辅助的靶向纳米孔测序，研究团队提出了一种分析SVs的替代方法。此方法允许以具有竞争力的成本进行灵活多样的SV分析。通过在样品上进行基于DLE的光学图谱，获得了范围广泛的SV信息，成本小于500美元。在一个one-pot转录反应中合成了实验所需的sgRNA，价格不到5美元。在一个flongle对样本进行了测序（大约70美元）。最近，团队报告了在一次反应中合成和使用多达200个合成的gRNA，进一步扩大了该分析在SV分析中的适用性。此方法依靠PCR来抵消flongle上的低数据产量。进行PCR富集使分析更经济，但目标大小限制在25-30kbp以下。也可以在不使用PCR的情况下使用此方法来分析更大的SV。然而，如果不进行PCR富集，就需要更多的基因组输入DNA和更多的数据才能在目标位点实现类似的覆盖率，这增加了成本。对于更复杂的SVs，多色全基因组图谱可用于创建样本的自定义图谱，并验证实验中使用的gRNA组合。使用此通用方法，可以针对样本中的多个SV，或跨多个样本分析SV，从而经济地精确检测断点。