FDA | 用于新冠血清学中和抗体测试的开发商模板

J.  性能评估

应进行以下确认研究以支持你的EUA申请。请注意，特别是对于新技术，FDA可能会要求额外的研究，以便我们能够充分评估与考核方法相关的已知和潜在的风险和益处。[对于每个确认研究，你应该提供一个研究方案，包括详细的、逐步的描述如何准备样品和如何进行测试。你还应包括每项确认研究的研究数据，以兼容Excel的方法提供给所有确认研究。过程数据记录应根据测试结果的解释，介绍每个重复的最终候选血清学测试结果。如果考核方法有数字输出，你应该包括每个重复的数字值]。

1)     分析灵敏度和特异性：

a)     包容性（分析反应性）：

随着病毒的传播，SARS-CoV-2基因组的突变已经被发现。突变是指SARS-CoV-2病毒序列与参考序列（如Wuhan-Hu1或USA-WA1/2020）相比发生的个别基因变化。一个新的SARS-CoV-2病毒变体有一个或多个突变，使其区别于已经在普通人群中流通的野生型或主要的病毒变体。SARS-CoV-2的变种是通过基因组序列来识别的，这些序列包含RNA基因组的突变，可能导至病毒蛋白的氨基酸替换、插入和/或缺失。不同的变体可以导至不同的表型（例如，抗原性、传播性或毒力的不同）。相对于最初分离的病毒，病毒突变和病毒变体可能导至免疫原性的改变，这可能影响血清学测试的性能。例如，一些研究表明，已确定的变体（可能包含多个突变）可能影响一些抗体在体外中和病毒的能力。

测试开发商应持续监测可能影响血清学测试性能的新的和正在出现的病毒突变和变体。这包括评估序列数据库（如GISAID[1]数据库）中病毒突变的流行程度，因为在这些数据库中观察到的频率很高的突变可能标志着该突变在美国感染者中的比例越来越大。FDA目前认为显著频率大于5%（当考虑到最近一段时间内至少有2000个序列，如过去一周、一个月或一个季度）。监测还应该包括识别是否有多个可靠的报告表明某个病毒变体（可能有一个或多个突变）有可能增加毒力，增加传播，或以其他方式增加公共健康风险。鉴于突变和变种的发生率以及评估其影响的重要性，FDA建议至少每月进行一次监测。

对于上述被确认为普遍存在和/或具有临床意义的任何病毒突变和变体，你应该考虑由此产生的病毒蛋白中预测的氨基酸变化对你的测试设计至关重要。如果发现突变对你的测试设计至关重要，应使用临床（或伪造的，如有，适当）样品对突变和变体进行评估，以评估突变或变体对你的测试性能的影响。

突变的总体影响不应降低测试的临床性能5%或更多，或使测试的临床性能点估计值低于J.3.d节[2]所述的临床性能建议。

关于监测基因变异对血清学测试的影响，请参见FDA指南Policy for Evaluating Impact of Viral Mutations on COVID-19 Tests[3]。

FDA也有持续的监测工作，并可能将某一病毒突变或变体确定为具有临床意义，建议对其进行临床（或伪造的，如有，且适当）样品测试，以评估该突变或变体对你的测试性能的影响。

[请提供贵公司对新的和正在出现的SARS-CoV-2病毒突变和变体进行持续监测的计划，并评估已被确认为普遍存在和/或具有临床意义的突变和变体对贵公司测定性能的影响。]

[对于在你申请欧盟认证时，作为持续监测的一部分，已被确认为普遍存在和/或具有临床意义的突变和变体，请提供有关突变和变体对你的测试性能的潜在影响的信息，或解释如何充分减轻与你的器械在具有变体的个体样品中的未知性能有关的风险。]

b)   交叉反应（分析特异性）：

如果从经FDA授权的RT-PCR测试确定为SARS-CoV-2阴性的受试者中收集的至少75个独特样品，或在2019年12月之前在美国收集的样品，从针对以下病毒的疫苗接种和/或感染的高流行率人群中进行测试，并观察到特异性>95%，目前预计不会对以下病毒进行交叉反应测试：

[如果评估的是大量已知的独特阴性样品（至少观察到95%的特异性），而不是上述交叉反应物的特定样品，请包括足以证明测试的样品来自对上述病毒进行疫苗接种和/或感染的高发人群的信息，包括对测试样品的描述，如地理位置以及你所掌握的关于样品如何收集和来源的任何其他信息。]

[如果没有评估大量的已知阴性样品，请描述为评估上表中的交叉反应物而进行的交叉反应测试。请在你的描述中包括测试的样品数量和样品的制备方法]。

如果需要对交叉反应物进行测试以证明测试的交叉反应，则应对上述每种疾病/传染病剂/抗体类别的至少5个单独样品进行评估。

如果使用自然的临床样品，重要的是使用来自感染急性期或恢复期的基础疾病患者和接种特定传染病疫苗的个体的血清来评估交叉反应，以获得高浓度的基础疾病的抗体。如果为这项研究准备了带有基础疾病抗体的添加样品，那么在添加之前用考核方法确认「阴性样品」对SARS-CoV-2中和抗体是阴性的，这一点很重要。此外，如果在COVID-19大流行之前收集的基础条件的市售抗体检测组合可能是合适的，以确保该检测组合是SARS-CoV-2抗体阴性。

我们建议你在下表中列出你的结果，并计算出考核方法结果与预期结果之间的一致性。

表 | 交叉反应：[测试名称]下面是湿测试生物示例表

*如适用，请包括你的测试技术的信号输出（即数字结果）。

[如果你的测试表现出明显的交叉反应，会对所评估的任何病毒产生假阳性结果，请描述一个能充分减轻风险的计划。]

2)    特异性分类（如适用）

如果你的测试是为了检测总抗体而不区分不同的免疫球蛋白，那么这项研究就不适用。[在这种情况下，请注明本研究不适用]。

[如果你的测试是为了区分不同的免疫球蛋白，请描述用于评估特异性分类的方法]。

评估特异性分类的方法取决于测定方法。如果你在测试中使用了特性良好的抗IgG和抗IgM试剂，可能不需要进行特异性分类测试。在这种情况下，FDA建议描述试剂的特征以及这种特征如何支持特异性分类。

[如果你的测试需要进行特异性分类测试，请描述为证明该测定能准确检测每一类抗体（如IgG和IgM）而进行的一项或多项研究。这应包括描述为评估人类IgM与IgG交叉反应并因此产生假阳性结果的可能性而进行的研究，以及IgM与IgG竞争并产生假阴性结果的可能性。请说明测试的样品数量，以及每个样品的重复数量。如果研究中包括纯IgG和纯IgM的阳性质控，评估至少5个样品的两类抗体阳性（IgM阳性同时也是IgG阳性），一式两份，可能是合适的，如下表的例子所示。本研究中可用的阳性质控是合适的（如：单克隆、重组等）。单克隆抗体、重组抗体）。请提供任何特异性分类测试的研究方案和结果，包括过程数据记录]。

一种推荐的方法包括用二硫苏糖醇（DTT）处理样品，最终的IgG结果将不受影响，而最终的IgM信号将减少或为阴性。还应包括一个确认DTT活性的阳性质控。

与预期结果100%一致将确定抗体类别的特异性。

如果采用DTT处理方法，下面是IgM和IgG的示例表格：

3)    审批用临床研究

[请描述用于评估该测试的临床表现的临床研究。请注意，临床评估的建议取决于在研究时获得COVID-19疾病临床样品的情况和紧急情况的性质]。

为了确定考核方法的临床表现，应通过考核方法和参比方法对样品进行测试。审批用临床研究应在血清中进行，而不是在血浆中进行，因为潜在的干扰因素，如凝血因子，可能会阻止中和参比方法的成功运行。[如果使用血浆样品，应提供额外的确认，证明中和参比方法的性能不受使用血浆样品的影响。]

如果考核方法打算用于其他类型的样品，则应通过单独的基质比较研究对其进行确认。需要注意的是，对全血的考核方法性能应通过与中和参比方法的临床研究方案来评估，而不是在基质等效研究中评估。器械对指尖全血样品的性能应与对血清样品的性能分开报告。

a.    参比方法

参比方法应该是一种被广泛接受和确立的测量中和抗体的测定（「中和参比方法」）。中和参比方法用于确定临床上是否存在对SARS-CoV-2的中和抗体的真实性，对于定量测试，用于确定样品中的中和抗体的滴度。中和参比方法应该是直接测量针对SARS-CoV-2活病毒的中和抗体的测试（即中和参比方法）。目前，斑块还原中和测试（PRNT）被认为是检测和测量中和抗体滴度的黄金标准。如果没有测量荧光，微中和测定和焦点还原中和测试（FRNT）也被认为是合适的中和参比方法。中和参比方法应使用与SARS-CoV-2活病毒混合的血清进行。使用重组的活病毒一般不合适。

在审批用临床研究中使用之前，应确认中和参比方法。确认中和参比方法的性能和对结果的解释可能是一个挑战。为了尽量减少中和参比方法的背景和/或潜在的交叉反应，并证明中和参比方法的有效性，我们建议：

Ø  中和参比方法的临界值应该用有据可查的SARS-CoV-2阴性样品检测组合来确定。我们建议使用在COVID-19之前（即2019年12月之前）收集的至少75个临床样品，包括至少10个抗HIV阳性样品。适当的中和参比方法的假阳性率应低于5%。请注意，使用这些样品来确定考核方法的临界值是不合适的。

Ø  应使用患有其他呼吸道传染病的有症状和恢复期受试者的样品进行交叉反应测试。

Ø  为了确定中和参比方法的性能，应评估来自30名恢复期受试者的样品，这些受试者曾被FDA授权的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）SARS-CoV-2测定证实为阳性。我们建议只使用FDA授权的高灵敏度RT-PCR测定，该方法使用化学裂解步骤，然后进行核酸的固相萃取（例如，磁珠萃取）。如果有的话，FDA建议选择一种已经建立了高灵敏度的国际公认标准或FDA SARS-CoV-2参考检测组合的RT-PCR测试方法[4]。如果不确定，请向FDA查询。这些样品可以包括在审批用临床研究中。

应提供以下信息以证明你的中和参比方法的有效性：

Ø  [中和参比方法方法确认研究方案，包括在与病毒混合前对血清样品进行热灭活的记录，以及使用阳性（可使用现有的中和单克隆抗体或抗血清）和阴性（可使用COVID-19前的样品）对照组；

Ø  SARS-CoV-2的分离物信息；

Ø  用来确认先前SARS-CoV-2感染的RT-PCR方法。每个样品所使用的RT-PCR方法应该被记录下来；依靠研究对象自我报告的RT-PCR结果是不合适的；

Ø  对用于中和参比方法方法确认的样品的详细描述，包括如何对样品进行定性和/或收集；以及

Ø  支持中和参比方法有效性的数据，包括临界值和与预期使用人群中其他呼吸道病毒抗体的交叉反应]。

b.    审批用临床研究人群

理想的情况是，通过在美国收集的前瞻性样品的临床研究来确定性能特征，以反映该器械的预期使用人群。如果前瞻性研究不可行，适当的方法是测试存档的SARS-CoV-2中和抗体阳性的样品。为了避免在研究中引入偏见，在用中和参比方法和考核方法进行测试之前，不应该用其他血清学测试方法预选样品。这些样品应来自先前被FDA授权的SARS-CoV-2 RT-PCR测试确认感染的个体，并附有基本信息，如样品的来源、样品采集日期、发病日期（如果存在/已知）、FDA授权的RT-PCR测试以确认个体为SARS-CoV-2感染者（见下文第1至12项），以及RT-PCR采集/测试日期。在设计你的审批用临床研究时，对于检测与中和参比方法相关结合抗体的器械，你应该考虑结合抗体和中和抗体之间的相关性可能会因症状发生后的样品采集时间和症状严重程度而有所不同。

在考核方法和中和参比方法之间的临床一致性研究中，可以使用用于确认中和参比方法的相同阳性样品。但是，为了确定考核方法的临界值，应该使用不同的独立临床样品。

[请提供一份完整的研究设计说明，包括关于受试者注册标准的细节，以及在将你的器械与中和参比方法进行比较时，如何收集样品以尽量减少假阳性结果。请在研究方案中具体说明以下内容：

Ø  样品是如何产生、收集和来源的；

Ø  如果样品完全是前瞻性的，回顾性的，或前瞻性和回顾性的混合；

Ø  纳入/排除标准；

Ø  采集和测试地点；

Ø  采集样品的日期（用于PCR测试）；

Ø  样品采集日期（用于中和参比方法测试）；

Ø  采集血液进行考核方法的日期；

Ø  参加研究的人数；

Ø  收集和测试的样品数量；

Ø  进行测试的操作员数量；

Ø  症状的严重程度；以及。

Ø  从症状出现到采血时的天数。]

[清楚地描述所使用的数据分析方法，并提供研究的结果，包括过程数据记录]。

c.    临床研究方案样品量

所有用于确定临床研究方案的样品都应该从已经感染了SARS-CoV-2的人身上采集，这些人是由FDA授权的RT-PCR测试确定的，因为这些人代表了这个装置的预期使用人群。

应提供至少75个独特的血清样品的临床一致性数据，这些样品通过中和参比方法是阴性的，并且收集自SARS-CoV-2 RT-PCR结果为阳性的个体。

还应使用至少30个独特的血清样品提供临床一致性数据，这些血清样品通过中和参比方法呈阳性，并收集自先前SARS-CoV-2 RT-PCR阳性者。

对于所有的测试，应将盲法和随机化纳入研究设计中。

d.    临床研究方案数据分析和接受标准

下表是一个例子，说明你可以提出你的器械和中和参比方法方法之间的正百分比研究方案（PPA）和负百分比研究方案（NPA）：

*CI：置信区间；95%的CI应使用评分法计算（Wilson）。

对于检测中和抗体或与之相关的测试，临床研究方案数据应至少证明以下内容：

Ø  90%的PPA；和

Ø  95%的NPA。

如果评估的独特样品数量较多（即超过30个独特的阳性样品和75个独特的阴性样品，由中和参比方法确定），下列点估计和置信区间可能是合适的：

Ø  PPA不低于87%，95%置信区间下限大于74.4%；

Ø  NPA不低于93%，95%置信区间下限大于87.8%。

4)    基质等效性

[请描述任何基质等效研究的研究方案，并提供任何基质等效研究的结果，以支持在初始审批用临床研究中没有评估样品类型（血清、乙二胺四乙酸（EDTA）血浆、静脉穿刺全血、不同抗凝剂等）的测定性能。对于有数字结果的测试，FDA建议提供回归分析（如Deming或Passing-Bablok回归），比较用对比样品类型和其他样品类型得到的结果。]

请注意：指尖全血与静脉穿刺全血不被认为是同一样品类型。用指尖全血进行测试的性能应通过与中和参比方法的临床研究方案进行评估，而不是在基质等效研究中进行评估（请见上文J（3）节）。

基质等效性研究是为了评估那些最初没有评估过的临床研究方案的样品基质。在这些研究中，正在进行的临床研究的基质是对比基质/样品类型，每个基质组（全血、血浆、血清）都来自同一个捐赠者（即配对/匹配样品）。

通常情况下，对阴性、弱阳性（例如，对于侧向层析测试，预期产生微弱测试线的样品，对于有基础信号值的测试，是测定临界值的2到3倍）和中度阳性（例如，对于侧向层析测试，强烈的测试线，对于有基础信号值的测试，是测定临界值的5倍）进行评估。[请详细说明在进行基质等效研究之前，如何制备样品以及用什么方法来确定这些样品中存在的SARS-CoV-2抗体浓度]。应评估5个样品，每个浓度一式两份，每个基质共30个结果（假设评估了3个浓度）。为了便于比较，每种样品类型/基质的阴性样品都添加了相同数量的分析物（SARS-CoV-2抗体）。应使用阳性的自然临床样品来加注阴性的临床样品，因为重组抗体可能不能代表本地样品中的抗体的多样性。在添加SARS-CoV-2抗体之前，用考核方法确认样品的抗体血清阴性是很重要的。当用SARS-CoV-2抗体阳性样品添加阴性基质时，为了确保基质的完整性，添加的样品量不应该超过总样品量的15%。

对于所有的测试，盲法和随机化是研究设计的重要考虑。

对于这些类型的研究，通常是用候选测定对每个样品进行测试，并将比较基质获得的结果与每个受试者评估的每个额外基质的结果进行比较。计算每个基质相对于比较基质的PPA和NPA。每个基质比较（如血清与EDTA血浆等）至少要有95%的PPA和95%的NPA，才能证明基质之间的性能可以被认为是等同的。