开发｜高质量免疫测定试剂开发方法的研究

40多年来，医院、实验室和研究人员一直在使用免疫测定法来快速诊断各种健康、疾病和药物治疗状况。通过这些测试获得的信息有助于识别有症状的疾病，并改善病人的治疗方案。

在生命科学研究中，免疫测定被用来确定结合率，定量蛋白质表达水平和样品浓度，并解开复杂的分子相互作用，以推进生物研究，而在工业中，它们被用来检测我们食品和水中的污染物。这些快速而准确的测试属于经常被描述为‘结合测定’的更广泛类别的方法（图1）。

图1 | 传统的免疫测定夹心法

免疫测定的开发者一直在努力创造测试，以满足未满足的诊断需求。这样做将使他们获得比竞争对手更多的先发优势。

但是，无论一种检测方法有多创新，如果它不能保证其稳定性，始终如一地检出结果，它就不可能产生重复购买，最终会失败。在任何技术平台上实现良好检测性能的一个关键前提是设计、生产和表征具有高度选择性和灵敏度的高质量试剂。

必须解决采购试剂方面存的挑战，以开发新的、精确的、适合目的的免疫测定。下文强调了开发免疫测定试剂的一些关键考虑因素。为试剂开发者和开发依赖合格试剂检测方法的人概述了避免常见陷阱的步骤。

开始免疫测定开发过程的关键环节包括选择需要测量的分析物、进行测量的样品基质，以及确定测定的关键成功因素，例如，灵敏度、通量和动态范围。

接下来是一个筛选过程，涉及抗体试剂，以确定和鉴定最佳抗体对。通常情况下，开发科学家会考虑已经在市场上销售的或内部生产的试剂。然后，他们进行一个漫长而昂贵的试错过程，可能需要测试来自不同供应商的多种试剂，以找到合适的试剂。

在这个过程中，需要测试开发商和试剂供应商密切合作，因为改善这一过程的关键是以所需测试读数为起点。这将有助于消除在鉴定基本试剂时的一些猜测。试剂供应商提供的信息也很有用，例如：

➤  来源和特性；

➤  灵敏度，以及试剂和目标分析物之间的特定和选择性的相互作用；

➤  浓度；

➤  配方；

➤  储存和使用条件；

➤  有效期。

掌握了这些信息，检测开发人员就能找出生物活性和生物物理特性的最佳组合，从而获得理想的免疫检测结果。

2.1、适用性

试剂对感兴趣分析物的特异性是最重要的。结合特性不仅决定了试剂的适用性，还决定了检测的灵敏度和稳健性。试剂开发者不能浪费时间或费用，用那些几乎不提供关于一阶抗体特异性信息的试剂进行实验。

对所有试剂进行全面的生物物理和功能表征是很重要的，不管它们是来自内部还是外部供应商。这意味着要利用更多信息丰富的技术，如表面等离子体共振，SPR（图2）。

图2 | 在Biacore传感器图中观察到的表面等离子体共振结合曲线，提供了以共振单位（RU）衡量的分析物-目标结合的实时信息

SPR有可能定位试剂相互作用的表位，以及结构（构象变化、糖基化、聚集等）和功能方面非常微妙的变化。拥有这种类型的信息有助于确定有前途的试剂，以及可以对抗原性较低的蛋白质进行具体的序列修改。

结合不仅取决于组成抗体的亲和力，而且还取决于它们各自的浓度，而这些浓度往往很难确定。如果使用试剂中实际活性结合抗体的浓度太低，会很难让测定工作起来。

拥有活性浓度数据将有助于避免这个问题。适合评估试剂浓度的分析方法包括功能测试（如酶联免疫吸附试验，ELISA或SPR）。SPR方法不仅可以提供关于目标结合亲和力和结合动力学的信息，而且还可以评估相对活性浓度，以及与未标记的试剂来源相比，标记对试剂特性的影响。

2.2、行为

在选择关键试剂时，仅有结合亲和力信息是不够的。试剂如果有低分子量的相互作用伙伴，或者在生产、运输或储存过程中受到物理化学压力（pH值、温度、搅拌和氧化），会影响结合（亲和力、通畅率和断续率，图3）。

图3 | 具有相似亲和力的分析物-目标物相互作用可能具有非常不同的动力学特性，这可能导至不同的生物反应。粘合作用的接通率反映了结合伙伴之间的识别，而断开率表明了相互作用的稳定性。通过将亲和力分解为通频和断频，可以获得关于分子相互作用的动力学与蛋白质功能的关系的全面信息。开通率反映了相互作用的伙伴之间的识别，而关闭率表明复合物的稳定性。

一种试剂与目标的结合可能比另一种快或慢。然而，如果一种特定的试剂结合得快，但解离得也快，检测结果可能是零值。开发人员真正想快速识别是否有另一种具有相同亲和力的抗体与目标物结合的时间更长。

对于免疫测定的开发者来说，了解试剂在37℃温度下是否有活性也很重要（对于人体样本）。如果在最初的评估中没有预计到这一点，可能会给测定的开发带来很大的挫折。试剂供应商应提供关于试剂储存和处理条件的详细描述。

配方信息也很关键，因为有些成分（如稳定蛋白）可能会干扰用于鉴定试剂特性的分析方法。如果试剂配方中存在其他稳定蛋白，那么它在检测中本身就会给出一个字符串信号，从而使结果失去意义。一些商业免疫测定制造商通过在反应缓冲液中加入非免疫阻断剂，尽力减少这种干扰的风险。

有很多技术可以对试剂结合进行快速筛选，如ELISA，这是一种终点法技术。终点法技术提供的是相互作用的快照，只提供基本信息，如整体结合强度（亲和力）。亲和力取决于通入和通出的比例，因此同等亲和力的相互作用可以有非常不同的动力学特性，从而导至不同的结合特性。

表面等离子体共振（SPR）可以实时提供关键的结合数据，以辨别这些关键的差异，例如结合动力学。SPR也可用于确定分子相互作用的热力学，以帮助检测开发商了解蛋白质-蛋白质相互作用的基本驱动力。

另一个考虑因素是产生预期反应之外的结果的交叉反应的可能性。一些自然发生的抗原是由几个表位组成的大分子混合物（例如，来自病原体、毒素或花粉）。与复杂的抗原如病毒接触，会刺激对病毒的不同大分子以及每个大分子的个别表位的多种免疫反应。交叉反应会产生假阳性结果，因此是验证检测试剂的一个通常评估的参数。

2.3、其他因素

关键试剂通常使用生物工艺生产，在制备不同批次的试剂时可能容易出现变异。这可能导至杂质概况的变化和蛋白质结构的改变。试剂开发商采用的策略是尽可能从同一供应商和同一批次采购材料，以控制批次间的变化。

但这并不是一个理想的长期解决方案。为了确保可持续的高质量供应，试剂应该根据经过审查的生产协议产生，并有明确的规格，对质量控制进行适当的描述，并对长期稳定性进行研究。试剂供应商如果采用符合医疗使用标准的质量管理系统，肯定会接受再次购买，并与检测开发商建立长期的伙伴关系。

人们对新型的、符合目的的免疫测定有持续的需求。尽管存在挑战，但对检测开发商来说，简化关键试剂的选择和可能的修改，以使他们的测试更快进入市场是很重要的。

例如，由Biacore SPR系统提供的SPR方法，在理解分子机制和结构-功能关系方面能够进行更精确的相互作用分析，为增加对生物化学机制的理解铺平道路。重要的是，它有可能简化免疫测定试剂的选择，这有助于让这些重要的测试更快进入临床医生的手中。