磁珠是指一类具有超顺磁性的微球，其在外部磁场中具有强磁性，可固定聚集；而当磁场撤去时，磁性则很快消失，可重新分散悬浮。基于磁珠的这个特性，生物医药界开发了其各种各样的应用方向。特别是在体外诊断行业，磁珠就像具有魔力的小精灵，为产业的发展打开了新思路。今天，主要聊聊它的基本性能，及其在核酸提取纯化中的应用。磁珠一般由具有磁性的无机材料（如Fe3O4）和带有特异基团的有机材料组成，根据磁性材料与有机材料的相对位置，可把磁珠分为核壳型、壳核型、夹心型、弥散型等结构类型，其中，核壳型是较常用的结构类型（图1）。磁珠作为一种生物原材料，决定其应用价值的性能主要与四大要素有关：①形貌：磁珠的形貌包含几何形状、表面粗糙度和内部结构等，磁珠可为光滑的球状、或为不规则颗粒状，内部结构可为多孔间隙或实心等（图2）；②材料：磁珠壳层的聚合物材料可为磁核提供保护，增强机械承载能力、提高耐酸碱度等，而且聚合物材料引入的不同基团，为磁珠的应用方向确立了基础；③尺寸：粒径大小是磁珠最直观的参数之一，其尺寸包含微米级、亚微米和纳米级，核酸提取纯化中常用磁珠粒径为500~2000nm，一般较大尺寸的磁珠，含有的磁含量也较多，磁力也就更强，但磁珠尺寸越大，其沉降速率也越快；④官能团：磁珠壳层的多聚物本身可引入一些基本基团，如羟基(-OH)、氨基(-NH2)、羧基(-COOH)和巯基(-SH)等，含有这些基团的基础磁珠即可用于核酸分离纯化等，基础磁珠也可进一步改性或修饰成更加多样的官能团，如耦联寡核苷酸或蛋白质等，进一步拓展其应用范围（图3）。基于磁珠的四大基本要素，在筛选一款合适的磁珠时，可从以下几个方面进行评估测试。①磁响应能力：指磁珠在外加磁场中的聚集速度，单从磁珠的物理性能看，磁响应速度应越快越好，但在实际测试中，还需结合磁珠的其他性能和仪器的磁力进行评估选择，只要满足需求，适合的磁响应能力即可。②分散性：指磁珠在溶液中的悬浮能力，以及磁性分离后，再次重悬的状态，良好的分散性可让磁珠与溶液充分混合，提高磁珠对目标物的捕获能力以及洗涤时杂质的去除效果，同时可减少操作过程中反复混匀的步骤，不过分散性较好的磁珠，其磁响应能力可能更差，需要平衡两者的优势与不足，以筛选出物理性能较为合适的磁珠。③载量：指磁珠对目标物的吸附或捕获能力，相比其他固相载体，磁珠本身较大的比表面积，可提高磁珠对目标物的结合能力，另外其表面官能团含量，也会影响磁珠对目标物的结合效率。④产物质量：基于产物后续应用方向考虑，对于洗脱的产物，需评估磁珠对捕获物的释放效率；若产物用于荧光检测、酶反应，或需保留产物活性时，还需评估磁珠对产物后续应用的影响。实际上，确定一款磁珠，需要综合反应体系的缓冲液、操作仪器以及下游应用进行全面评估测试，这样才能筛选出适合自己体系的最好原材料。磁珠在体外诊断中的重要价值之一，是用于核酸的分离纯化。其在核酸分离纯化中的应用，推进了该行业在高通量、自动化上的进程。从磁珠对核酸分离纯化的具体应用中，我们可以将其分为3类。①核酸纯化：主要用于PCR产物的纯化和富集，以去除反应中的核酸小片段（如引物二聚体）和蛋白质（如酶）等；该类试剂还可用于核酸片段的分选，即通过调整溶液浓度，使得溶液中的大片段核酸结合于磁珠上、而小片段核酸存留于溶液中，从而实现不同核酸片段的分离，如贝克曼的AMPure XP磁珠，其对核酸片段的分选，是NGS文库构建过程中的重要步骤之一。②核酸提取：主要用于从原始样本中纯化富集核酸，该方法需要在溶液中，加入可破坏细胞或病原体结构的变性剂，使得样本裂解释放核酸，并在溶液中其他离子的作用下吸附核酸，再经过清洗去除杂质，获取可用于下游检测的核酸，该方法是磁珠在核酸提取纯化中最为广泛的应用。③核酸捕获：通过在磁珠上耦联特异性官能团，使得磁珠可更加明确的捕获目标物，如在磁珠上耦联寡核苷酸，可对互补序列进行杂交捕获；或在磁珠上耦联链霉亲和素，可与带有生物素标记的目标核酸结合。核酸分子在水溶液中，依靠分子间的非共价作用力（静电相互作用、范德华力和氢键），处于稳定分散状态，其原因为：核酸分子本身带有多个磷酸基团，呈高度负电性，分子间的互相排斥可避免发生聚集；另外，核酸分子在水溶液中通过氢键与范德华力结合了大量的水分子在其周围，形成水化层，阻止了分子间的聚集。因此，对于一些基础磁珠，可通过调节这些非共价作用力的相互关系，使得核酸与磁珠表面接触，从而被磁珠吸附。以下，将以不同官能团的磁珠为例，对核酸与磁珠的相互作用原理进行描述。①氨基磁珠：氨基磁珠带有正电荷，可通过静电作用吸附带有负电荷的核酸，调节pH值便可实现核酸分子在表面的可逆结合。②羟基磁珠：此类磁珠通常配合高浓度离液盐（如盐酸胍、异硫氰酸胍、高氯酸钠和碘化钠等），对核酸进行提取。溶液中的高浓度盐离子可屏蔽溶液中的静电斥力，另外，离液盐离子可竞争性地与磁珠表面和核酸分子结合，破坏两者表面的水化层，促使磁珠与核酸分子通过氢键和范德华力相互靠近吸附。③羧基磁珠：该类磁珠除可像羟基磁珠一样，通过加入高浓度离液盐，吸附核酸分子外；还可通过加入不同浓度的聚乙二醇(PEG)和NaCl，实现不同核酸片段的筛选。核酸分子在一定浓度的PEG和NaCl中，会发生脱水反应，分子构象急剧变化，由线状蜷缩成小球状，继而聚集沉淀，同时暴露出磷酸骨架上带负电荷的磷酸基团，借由解离的盐离子(如Na+)与磁珠表面的羧基形成离子桥，使核酸被吸附至磁珠表面。而且，核酸分子量越大，越倾向于与磁珠结合，因此，通过调节溶液与核酸样本的体积比，则可促使较大分子量的核酸片段优先吸附于羧基磁珠表面，从而达到核酸片段的筛选效应。④寡核苷酸磁珠：通过碱基互补配对原则，与靶核酸序列结合，如耦联oligo dT的磁珠可捕获含有poly A的核酸。⑤链霉亲和素磁珠：基于链霉亲和素-生物素系统具有极高的结合亲和力，对带有生物素标记的核酸进行特异性捕获。 磁珠的良好性能，特别适用于核酸提取纯化的高通量和自动化操作。市面上基于磁珠法的自动化提取设备，从其对磁珠和液体分离过程中的差别，大致可分为3类。 ①磁棒法：通过转移磁珠实现核酸的分离纯化，一般通过仪器里磁棒的运动，将磁珠依次从样本裂解/结合液到洗涤液，再到洗脱液方向进行转移，从而实现核酸提取纯化的全自动过程（图4）。该方法对应的仪器简单方便，但该方法仅可完成核酸的提取纯化步骤，最后的洗脱产物还需手动或采用移液设备，转移至检测管中进行检测。 ②移液法：通过转移液体实现核酸的提取纯化，一般通过操作系统控制机械臂完成移液。在操作过程中，当磁珠在外部磁铁作用下磁性分离时，仪器吸取废液转移至废液槽中；当撤去外部磁场后，可换用新的吸头，加入其他干净的液体，由此完成核酸的提取纯化（图5）。该仪器可将核酸分离纯化过程中用到的模块（如加热、震荡混匀、磁性分离等）进行分区排布，依靠机械臂的移动，形成全自动流水线操作。③分液法：通过枪头磁性分离技术，将磁珠与液体分离开来。在提取过程中，外部磁铁将磁珠吸附在枪头内侧壁，液体则可排出。该仪器从操作过程上看，具有磁棒法固定并转移磁珠的功能，也具有移液法转移和混匀液体的功能。 磁珠作为一种磁性小颗粒，可分散于液体基质中，也可通过磁性分离聚集成团，兼具液体的流动性和载体固定化的双重特点，使其在核酸分离纯化的高通量、自动化操作上大展拳脚。磁珠法提取的核酸，确保了分子检测第一步的质量，使得检测结果更加准确可靠。
但是，引入的磁珠在操作过程中，需通过外加磁场实现固液分离，磁珠的转移和重悬也需要外加力量的驱动，使得磁珠法在提取核酸时，对设备有一定的要求；同时磁珠分离纯化核酸的过程，一般包括裂解结合-洗涤-洗脱这几个步骤，需要一定的时间来完成这些操作。因此，在处理数量较多的样本时，结合自动化设备，磁珠法可发挥其优势；而对设备要求更加简便的产品（如家庭自检产品），磁珠法提取核酸的适用性还有待开发。[1] Ruffert C. Magnetic bead-magic bullet[J]. Micromachines, 2016, 7(2):21-21.[2] Palecek E, Fojta M. Magnetic beads as versatile tools for electrochemical DNA and protein biosensing[J]. Talanta, 2008, 74(3):276-290. |
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