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重磅文章解读丨柳叶刀子刊EBioMedicine:mNGS首次用于同时诊断感染和肿瘤

2021-12-3 15:42| 编辑: 归去来兮| 查看: 3457| 评论: 0|来源: 小桔灯网

摘要: 近日,北京大学人民医院检验科王辉教授团队在国际著名的柳叶刀子刊《EBioMedicine》(IF=8.143)发表了题为“Metagenomic next-generation sequencing to identify pathogens and cancer in lung biopsy tissue”的 ...

近日,北京大学人民医院检验科王辉教授团队在国际著名的柳叶刀子刊《EBioMedicine》(IF=8.143)发表了题为“Metagenomic next-generation sequencing to identify pathogens and cancer in lung biopsy tissue”的研究论文。王辉教授为本文通讯作者,杰毅生物王珺博士和丁文超博士共同参与了此项研究


不依赖培养、不需前提假设的宏基因组测序已成为诊断感染性疾病的有效方法,并迅速地从实验室研究过渡到临床应用。临床对疑似感染患者进行mNGS以识别病原体,但恶性肿瘤患者与感染患者的部分临床症状相似、难以鉴别,对此类患者进行常规mNGS检测时,结果可能为阴性。


染色体不稳定性作为一种重要的肿瘤标志物,已在科学研究中进行广泛讨论,但在临床诊断中应用较少。本研究基于mNGS可识别宿主染色体不稳定性的原理,对mNGS用于同时检测肺活检组织中的病原体和染色体不稳定性进行了研究,并且探讨了基于Illumina和Nanopore测序平台的宏基因组测序在肺活检组织中的病原体诊断价值。结果显示,以病理结果为金标准,mNGS对于恶性肿瘤的临床诊断敏感性、特异性、准确率分别为83.7%、97.6%、92.9%;Illumina测序在感染诊断中的敏感性和特异性分别为77.6%和97.6%,而Nanopore测序的敏感性为34.7%,特异性为98.7%。本研究数据显示illumina平台在肺活检组织的病原体检测性能显著优于Nanopore平台。



图. 本研究的工作流程示意图


病人特征

本研究纳入北京大学人民医院检验科133例疑似肺部感染或胸部影像学异常的肺活检组织标本,并根据CAP、HAP和疑似感染的诊断标准,分为LRTI组(Lower respiratory tract infection, n=49)和非LRTI组(n=84)。非LRTI组的恶性肿瘤发生率明显高于LRTI组(41.7% vs. 16.3%),LRTI组血液病患病率明显高于非LRTI组(14.3% vs. 3.6%)。LRTI组抗生素使用发生率显著高于非LRTI组,住院时间较非LRTI患者略长,白细胞计数、C反应蛋白、降钙素原均高于非LRTI组。

表. LRTIs和非LRTIs组患者的特点


Illumina和Nanopore测序对肺活检标本的检测性能

从标本接收到结果分析,Illumina测序比Nanopore测序的TAT长,比常规培养的TAT短。培养阳性率为13.5%(18/133),培养结合其他微生物检测(包括qPCR、ELISA、GeneXpert MTB/RIF和组织学检测等)的阳性率为32.3%(43/133)。Illumina测序的阳性率为30.1%(40/133),与培养结果相比,敏感性和特异性分别为83.3%和79.1%;与所有常规微生物检测相比,敏感性和特异性分别为74.4%和95.6%;与综合参考标准相比,敏感性和特异性分别为77.6%和97.6%。Nanopore测序的阳性率为14.6%(18/123),去除建库失败标本后,与培养结果相比,敏感性和特异性分别为38.9%和91.4%;与所有常规微生物检测相比,敏感性和特异性分别为33.3%和97.5%,与综合参考标准相比,临床敏感性和特异性分别为34.7%和98.7%。



表. Illumina和Nanopore测序相对于培养、所有常规微生物检测和复合参考标准的检测性能



图. 通过Illumina (a)和Nanopore (b)测序鉴定病原体的标本比例



结果不一致的标本信息


整体检测性能比较:133例肺活检标本中培养到20例病原体,其中2例标本存在合并感染,8例标本感染真菌,4例标本感染抗酸杆菌,其余8例标本感染其他细菌。其他微生物检测检出25例其他病原体:BALF培养鉴定3例,GM试验阳性7例,抗体阳性1例,PCR检测阳性14例。与Illumina测序和Nanopore测序结果对比发现:仅靠临床常规微生物检测识别病原体9例;Illumina测序额外识别病原体11例;Nanopore测序额外识别病原体4例;Illumina和Nanopore测序均阳性,但临床微生物检测结果为阴性的有3例;临床微生物检测结果与Illumina或Nanopore测序结果完全一致的总计38例。

真菌检测性能比较:2例标本的培养结果与Illumina和Nanopore测序结果均不一致。临床微生物检测和Illumina测序均检测到的真菌7例;临床微生物检测和Nanopore测序均检测到的真菌1例;三类方法均检测到的真菌6例;与临床微生物检测相比,Illumina和Nanopore测序额外识别了9例真菌,且与组织病理结果一致。

分枝杆菌检测性能比较:临床微生物检测检出分枝杆菌14例,Illumina和Nanopore测序分别检出10例和2例,通过Illumina测序鉴定了1例抗酸杆菌阳性病原体为堪萨斯分枝杆菌。共计4例分枝杆菌仅有临床微生物学检出,Illumina或Nanopore测序均未检测到分枝杆菌属,其中1例抗酸杆菌阳性,3例qPCR阳性。




图. 常规微生物检测(BALF培养、qPCR、ELISA、GeneXpert-TB、抗体)以及Illumina和Nanopore测序对所有微生物(c)、真菌(d)和分枝杆菌(e)的检测效率


图. 病原体检测的五种策略



基于illumina测序的染色体不稳定性检测

通过Illumina测序获得标本中的宿主序列,对127个肺活检组织标本(43例组织学上确诊为恶性肿瘤)进行染色体不稳定性分析,对肿瘤进行诊断。mNGS共检测到36例肿瘤患者,其中31例为临床和病原mNGS检测阴性的患者,5例为病原体检测阳性患者。与病理检查结果比较,mNGS对于肿瘤诊断的临床敏感性为83.7%,特异性为97.6%,准确率为92.9%。经临床结果证实,基于Illumina平台的mNGS同时检测到38例感染患者和36例癌症患者(包括18例初诊肺阴影、占位性病变或结节的患者)。


图. 基于Illumina测序平台的mNGS鉴定癌症患者染色体不稳定性


本研究首次证明了使用mNGS可以在肺活检组织标本中同时检测病原体感染和肿瘤。作者指出,基于Illumina测序平台的mNGS,分别以培养、微生物检测和综合参考为标准时,其敏感性较高;而Nanopore测序的灵敏度远低于此前报道,原因可能在于肺活检组织中病原体浓度可能低于体液,以及宿主背景(人源含量)较高。


研究发现mNGS可提高肺部真菌感染的诊断敏感性,与此前研究结果类似,有利于应对近年来肺部真菌感染发病率上升且早期诊断困难的现象,但作者建议在通过mNGS诊断真菌感染时,需结合其他临床检测方法(如GM试验或病理检测),以规避mNGS汇报背景污染的风险。本研究中mNGS对于分枝杆菌的检测敏感性较低,与此前报道不完全一致,可能是由于结核分枝杆菌序列数较低以及不同研究的波动性相关。本研究也对mNGS检测到CMV和EBV的患者进行分析,提出CMV和EBV在健康人群血液中也可以检出,但疱疹病毒的激活在造血干细胞移植后较常见,且与预后不良有关,因此建议mNGS检测到CMV或EBV时,应根据标本类型和临床症状进行解读。


另外,该研究首次指出,来自mNGS的宿主序列可以用于检测肿瘤患者的染色体不稳定性,且有助于提高肿瘤诊断的准确性和时效性(病理检查TAT约48小时),并降低检测成本,但仍存在少数标本的假阳性(2例)和假阴性(7例),因此需要根据更大的队列研究结果对判读阈值进行调整。研究还指出对于Nanopore测序平台而言,优势在于序列读长而非序列数量,而人源含量的高低会影响基因组的覆盖度,进而影响染色体不稳定性的判读。因此应用Nanopore测序平台的肿瘤判读模型仍要进一步调整。



总结


综上所述,本研究首次报道了基于Illumina测序平台的mNGS在肺活检组织标本中同时诊断感染和肿瘤。该技术可以有效地对影像学异常如肺部阴影、占位性病变或结节的患者提供肿瘤诊断。本研究建议在Nanopore测序的湿实验中进行去宿主操作,以提高病原体的检测敏感性。


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