刘博谈准确度｜有形成分定量计数准确度评价

有形成分分析产品主要用于分析样品中可观察到（借助显微镜等工具）的有形成分，如血液样品中的红细胞、白细胞、血小板，尿液中的红细胞、白细附管型、上皮、结晶、真菌等。

对有形成分的分析包括有形成分的分类和有形成分计数。

鉴于目前行业的发展水平，本文仅对有形成分的定量计数准确度评价提供参考建议，对有形成分的分类评价待行业的技术水平突破后再作补充。

目前，分析人体样品中有形成分的方法主要有流式技术和显微镜检验技术，其分析方法均是基于有形成分本身的性质，如有形成分的尺寸、形态和特性等。

这些有形成分不能溶解在基质中，因此其物理形态是一种悬浊液而非溶液。正是基于此，有形成分的定量有其自身特点，在进行准确度评价时需要特别注意。

除了被测量的物理形态具有差异外，作为体外诊断产品的类别之一，其准确度评价的总体方法与生化、免疫等产品有相似之处。

除本文中描述的差异外，之前我们谈到过的评价方法有时也适用于有形成分定量计数产品的准确度评价。

要评价有形成分定量计数产品的准确度，首先要了解该类产品的溯源途径。

流式技术在血液细胞分析中应用较成熟，国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐使用电阻抗法半自动单通道血液分析仪计数红细胞（RBC）和白细胞（WBCH）并将其确定为参考方法，也可将其作为血小板（PLT）计数的间接参考方法。

随着新技术的出现，数字成像系统和数字成像自动识别类仪器逐步被研发并投入市场。

和流式技术不同，数字成像类仪器模拟人工显微镜检验流程，通过观察一定体积样品中含有的目标数，在进行等量换算后即可得到单位体积中所包含的目标数（即目标物浓度）。

设观察的视野数为k，观察到第i种类别的目标总数为Ni，每个视野的样品体积为v（μL），则换算后样品中该类目标的浓度（Di）为

公式（1）中，对于给定系统，k和v为常数，不同项目的浓度结果和观察到该项目总目标数成正比，比例系数为 k x v。

该系数只要用其中一种目标物校准即可。

通常对系统定量计数的准确性可采用容易获得的颗粒（如红细胞或红细胞模拟颗粒）来校准。

而用于校准的颗粒则可采用ICSH推荐的电阻抗法半自动单通道血液分析仪来赋值，也可采用人工显微镜计数方法来赋值，但人工细胞计数劳动强度大、重复性差，且操作者需要较高的专业水平，目前已渐渐被自动分析仪所代替。

图1为血细胞自动计数仪分析红细胞和白细胞的参考方法与溯源途径。

图1|血细胞自动计数仪分析红细胞、白细胞的溯源链

有形成分定量计数产品的正确度评价包括正确度的确认和验证，评价方法与生化、免疫类产品基本相同，即可通过测试参考物质、回收试验和方法学比对等方法进行，具体可参考之前的文章。

对于血液学项目可参考WS/T 406 - 2012《临床血液学检验常规项目分析质量要求》中的「正确度」进行评价。

对于像尿液、粪便、体液等稳定性差的样品，生产厂家在进行正确度确认时，可通过与参考物质或参考测量程序比对进行确认。

由于目前这些有形成分分析项目尚无可用的有证参考物质，往往选择与参考测量程序或更可靠的测量程序进行比对。

考虑到样品中有形成分分布均匀性较差，在进行正确度研究实验时，每个样品的测实次数应不小于3次，样品量许可时，建议测试5~10次，以减少随机误差的影响。

有形成分定量计数产品的精密度评价包括精密度的确认和验证，由于有形成分产品的特殊性，其确认与验证的方法的和生化、免疫类产品存在一定的差异。

对血液学产品，评价方法可参考WS/T 406 - 2012《临床血液学检验常规项目分析质量要求》中的「批内精密度」和「日间精密度」。

对于尿液、粪便和体液类产品，由于其样品存在稳定性差的特点，不可能在不同的日期测定同一样品，故在进行精密度评价时，只评价重复性（批内精密度）。对于这类产品，目前国内尚无通用的标准可以参考。

对于尿液有形成分分析仪，其精密度评价可按照行业标准YY/T 0996 - 2015《尿液有形成分分析仪（数字成像自动识别）》进行重复性评价。

其他体液可参考2014版《ICSH体液细胞自动计数仪性能和验证》进行精密度评价，应尽可能对所有可能影响产品的变异因素进行评价。

用于精密度评价的测试样品应与临床样品具有相同的特性。

建议检测2个或多个浓度的样品。所有样品应至少测定10次。如果测定10次有困难，则应视可用的样品量而定，但为了能有效统计，至少应检测5次。如果患者样品不稳定，可用相应的质控品代替样品进行评价。

另外，基于有形成分的特殊性，在进行精密度评价时，需要对混匀方法特别关注。

有形成分定量计数产品的关键成分是细胞或模拟细胞颗粒，细胞型试剂按现有技术尚不适宜采用冻干形式封装，有形成分不能溶解在基质中，其物理形态是一种悬浊液而非溶液，很难保证分布均匀。

因此在评价精密度时，需要注意使用前的混匀方式。混匀时既要保证其中的有形成分分布充分均匀，又要防止有形成分破碎或聚集，因此不可采用过于剧烈的混匀方法。

对液体有形成分定量计数产品的手工混匀可采用颠倒混匀、手指拨动等。

由于手工操作存在个人手法的差异，因此操作的力度和时间需根据个人的实际情况摸索确定。

对于颠倒混匀方式，要注意瓶盖是否吸附细胞和开盖时试剂可能产生污染的问题。手指拨动法需要控制好拨动的力度，轻轻拨动即可，不可用力过猛。

为了避免手工混匀时因操作手法问题导至的不一致，也可采用微型振荡器进行混匀。需要注意的是，使用前要设置好合适的振荡频率和时间，通常选择频率500~600r/ min ，振荡时间以10min为宜。