精品课件| 李金明：mNGS的临床应用：目前的关键问题及对策思考

导言

      感染性疾病一直是全球范围内的重要公共卫生问题。在其诊疗中，快速、准确地识别病原体至关重要。传统检测方法主要包括形态学检测、培养分离、生化检测、免疫学和核酸检测等，操作简单、检测成本相对较低，同时具有较好的灵敏度和特异度，目前临床仍然广泛应用。然而，传统检测方法耗时较长，加之感染性疾病的病原体种类繁多，仅能针对几种常见病原体进行检测，且检测项目很大程度上依赖临床医师的判断，因此难以识别未知或罕见的病原体。

     随着测序技术的飞速发展，新一代高通量测序（NGS，next-generation
sequencing）技术已逐步应用于感染性疾病的诊断、治疗和监测。基于新一代测序技术的宏基因组测序（metagenomic mNGS）可以直接对临床标本中的所有核酸进行高通量测序，无需特异性扩增，更不需要微生物培养，因此可在较短时间内获得标本中的核酸序列，然后通过生物信息学判读分析病原体种类及丰度等信息。mNGS技术能够对核酸进行随机、无偏的全部测序，解决了需要提前预判、靶向检测的问题，且能覆盖较大范围的病原体，病毒、细菌、真菌、寄生虫都能被同时检测。此外，mNGS技术具有高灵敏度的检测能力。理论上讲，只要测到一条病原微生物的特征性序列，就可以得知病原体的存在。

    2016年，mNGS检测技术正式在中国临床上开始使用，并迅速成为临床病原微生物精准诊断领域「炙手可热」的焦点。但同时也要看到，mNGS不仅给我们提供了许多答案，还给我们提出了很多问题。比如人源DNA的干扰、参考数据库的完善、阳性判断的cut-off值、室内质量的控制、测序检测的费用等问题。

    mNGS对于新发或少见病原微生物的检出具有重要价值。但是从成本效益考虑，轻症感染以及使用传统检测方法能够明确诊断的感染，如尿路感染、皮肤软组织感染，不推荐使用mNGS检测。

   从技术本身的局限性考虑，人源性细胞较多或背景菌较多的感染标本，如粪便标本，也不太推荐使用mNGS检测。mNGS技术的主要临床适应症如下：

1、重症感染的诊断
    临床常见的重症感染有脓毒症、脑炎/脑膜炎、重症肺炎等。对于这些感染，mNGS技术有较高的临床应用价值，能够快速、精准地找到病原体。

2、慢性感染的诊断

   慢性感染通常反复发作，较难治愈。由于慢性感染的症状不典型，机体间断性排菌，临床实验室检测困难。

3、疑难复杂感染的诊断

     因为mNGS检测技术具有无偏倚性和全覆盖性，对疑难感染病例诊断具有重要作用。

4、免疫缺陷患者感染的诊断

免疫缺陷患者容易发生机会致病菌感染和混合感染，而且感染的病原体复杂多样，诊断困难。而mNGS不受免疫抑制程度的影响，具有良好的诊断潜力。 

同时需要注意的是，临床标本中人源细胞占比越高，mNGS检测灵敏度越低。一般而言，人源细胞占比由少到多的顺序是：脑脊液<肺泡灌洗液<血浆<痰液<胸腹水。即使是同一种类型的标本，若来源于不同个体，或来源于同一个体不同取材方法或不同取材时间，人源性细胞的比例都会相差几个数量级。有些标本如粪便、坏死组织等，因背景太杂，在目前的技术背景下不适合做mNGS检测。

mNGS检测技术弥补了传统病原学检测方法的不足，在感染性疾病的诊断中显示出巨大的临床应用价值，已被多个指南和共识推荐。同时，mNGS临床应用仍面临一些问题，需要不断完善，如：标本的采集、核酸提取、基因文库构建、试剂选择、测序数据量和生物信息分析标准化等等。另外，mNGS检测成本较高，外送检测周转时间较长。且mNGS作为一种新型检测方法，阳性结果仅代表临床标本中检出某病原体的核酸片段，无法确定该病原体与感染之间的关系，在有条件的情况下，还应用其他方法或者感染相关的标志物进行相互验证。因此，mNGS尚不宜作为常规检测技术，需要掌握适应症。

随着测序技术的发展以及越来越多的医院临床实验室自主开展mNGS检测，建立规范化检测流程和结果判读标准已成为业内专家的共识。预计在未来几年内，mNGS操作将更加自动化，流程更加标准化，成本亦将显著降低，有望成为感染性疾病病原学诊断的常规检。

      那么，mNGS在临床中的实际应用如何？在临床实验室中又面临着怎样的挑战？如何克服这些挑战？今天给大家带来的是国家卫健委临床检验中心李金明老师关于《mNGS的临床应用：目前的关键问题及对策思考》的培训课件，希望对大家有所帮助。