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分子检验丨MassARRAY技术介绍

2021-10-19 10:25| 编辑: 归去来兮| 查看: 1308| 评论: 0|来源: 基因talks

摘要: 前 言基因的变异类型有多种(点击查看),对应的分子检测方法亦有多种,当前资本市场驱动着分子检测市场,并极力追捧NGS技术,因为其通量高,灵敏度高且性价比高。小编承认NGS是分子检测的必然发展趋势,但是短时间 ...


前 言

基因的变异类型有多种(点击查看),对应的分子检测方法亦有多种,当前资本市场驱动着分子检测市场,并极力追捧NGS技术,因为其通量高,灵敏度高且性价比高。小编承认NGS是分子检测的必然发展趋势,但是短时间内,NGS并不会取代其他分子检测方法,因为针对不同的需求,都有对应的理想检测方法,每个检测平台都有着自己的优势,比如:


操作简单:PCR,ARMS-PCR,HRM等

时间快速:ARMS-PCR,HRM等

成本低:PCR,PCR-RFLP,MassARRAY等

准确:Sanger等

通量高:NGS等

灵活性:Pyrosequencing等

结果分析简单:ARMS-PCR等

自动化:核酸提取等

......


一直认为:没有最好的技术,只有最合适的技术最好的,不一定是最合适的;最合适的,才是真正最好的。



现在,质谱分析在医学临床诊断和研究方面变得非常普遍,我们可能经常会听到用XX质谱分析在临床检验某种遗传代谢性疾病,提及质谱我们一般都会想到气相色谱质谱联用串联质谱遗传代谢病、代谢组学(有机酸、氨基酸、脂肪酸等等。但是当有一天,我们听到用质谱检测核酸的时候,是不是会有一种错觉?这么“粗糙”的质谱能检测这么“精细”的核酸分子?

对,没错,有一款质谱可以检测核酸分子,它就是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,MassARRAY-MALDI-TOF-MS!

今天,我们聊一聊MassARRAY技术,首先,我们先了解下什么是MassARRAY?

MassARRAY:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS) ,在基质辅助下使结合后的分子发生电离,产生的离子在电场作用下加速通过飞行管道,它们的质量和所带电荷可以影响其飞行时间,因此,根据它们到达检测器飞行时间的不同对待检测物进行分离。


MassARRAY检测原理


MassARRAY飞行质谱的原理是样品分析物与芯片基质(硅化合物)共价结合形成结晶后在质谱仪的真空腔中经高能激光激发,核酸分子解吸附为单电荷离子;在电场中离子飞行时间与离子的质量成反比相关,通过检测解吸的核酸分子在真空腔中飞行的时间从而计算获得样品分析物的精确分子量,进而得到分析物的基因型信息。该平台使用的是垂直飞行模式。


MassARRAY平台的iPLEX检测基因分型的原理是,对PCR扩增的目标序列,进行MassEXTEND单基因延伸反应,该反应是紧挨着SNP位点设计一段探针,在反应体系中以ddNTP替代dNTP,使得探针在SNP位点处延伸一个碱基即终止,在反应体系根据SNP位点的不同,探针将结合不同的ddNTP,生成不同分子量的产物。延伸的产物与芯片基质结合形成化合物后再通过飞行质谱进行基因型分析。


DNA甲基化检测原理:MassARRAY分子量阵列基因分析系统EpiTYPER DNA甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应(MassCLEAVE)和MALDI-TOF测序原理。与其他测序方法检测DNA甲基化一样,MassARRAY平台也是应用经过亚硫酸盐处理,DNA中的未甲基化的胞嘧啶(C)转为尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶不会发生改变,甲基化的胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶(转变成U)由于分子量不同,因此可以区分。利用5,末端带有T7启动子的引物进行PCR扩增,产物经虾碱性磷酸酶(SAP)处理后,转录并进行碱基特异性的酶切反应(MassCLEAVE),最终生成不同分子量的检测产物(图3)。酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后碱基的变化。


实验流程简单解析


1,首先,针对于A/G两个不同的SNP进行检测,我们需要设计两对PCR引物,并且上下游的引物两端需要加上10 mer tag (ACGTTGGATG),这个主要的目的是为了使PCR引物≥30bp(后面SAP没有完全消化掉PCR引物,它也不会出现在最后的质谱图上,质谱图峰检测的范围是4500Da~9000Da之间,ATCG的分子质量约为300Da,那么对应检测的范围是15~30bp之间)。


2,通过PCR引物扩增后,可以进行目的片段的富集。


3,PCR扩增后,我们需要进行SAP消化,去除多余的酶、buffer、mg2+、dNTP等试剂。


 4,杂交延伸扩增。


5,单碱基延伸扩增(以A/T/C/G终止)。最后我们通过质谱检测单碱基的峰图便可以直观的读出结果。


由于MassARRAY技术细节比较多,本篇篇幅可能不够介绍,感兴趣想深入学习的小伙伴可以点击下方的链接进行查看:

1,MassARRAY平台系统介绍

2,MassARRAY个人技术剖析

3,MassARRAY实验操作流程

4,MassARRAY平台项目设计 



MassARRAY法应用实例介绍


实例1:比如现在有一名结直肠癌患者,考虑是否使用西妥昔单抗,对KRAS  61号突变进行检测。


KRAS T/T野生型


KRAS G/T突变型


实例2:MassARRAY最大的优势就是其通量高,一管可以实现多个基因位点的检测,比如下图中17种基因型可以一次性检测(有些基因型不是对应一个SNP位点,所以左图下角有19个峰值)。


一管可以一次性检测多种基因型



整个实验主要操作步骤




MassARRAY技术点评

优点:

1,通量高;

2,成本低;

3,组合灵活;

4,灵敏度高。


缺点:

1,需要特殊的仪器设备;

2,不能检测未知的突变

3,每次检测样本和位点数有一定要求。


此方法适宜于有相关仪器的实验室,大量样本同时进行多位点分型检测。


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