临床PCR技术发展史

分子诊断是伴随分子生物学和基因分析技术发展起来的。在20世纪50年代之前，人们对遗传物质的研究仅停留在个体和细胞水平，直到1953年James Watson 和Francis Crick提出双螺旋结构模型，分子生物学时代从此开启。1971年Khorana等最早提出PCR理论、1976年极端嗜热菌中一种聚合酶的分离奠定了PCR技术的发展、1988年Saiki等从一种水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶，并简化了操作程序，最终实现了DNA扩增的目的，迅速推动了PCR的应用和普及。

PCR技术发展进化树

PCR技术从最早的酚氯仿核酸纯化方法和开发性电泳核酸鉴定，到采用“静态核酸制备技术”和封闭荧光信号收集，经历了5次更新换代（Generation）。新一代技术解决了上一代存在的问题，同时又提出了新的挑战。

“1G”：酚氯提取+电泳检测

划时代意义：由细胞水平进入基因水平的研究。

缺陷：移管、离心、弃液和洗脱等操作步骤多，核酸外泄，核酸废液开放丢弃；酚氯仿等核酸制备物质对操作人员有毒性伤害，废液污染环境。开放式检测、实验室污染成灾；肉眼判断结果、主观性强、灵敏度、重复性和特异性差。

“2G”：煮沸裂解+ 荧光探针技术

      优点：使用荧光探针或染料，将检测方式从开放式进化成封闭式信号检测，废除了1G技术的开放性鉴定方式，是重大进步。

      缺陷：最大的缺陷是采用100℃煮沸步骤，在当时离心管质量较差的2G,气溶胶是导至实验室污染的主要原因。“1G”的移管、离心、弃液和洗脱等步骤导至的核酸外泄缺陷持续存在。

“3G”：“微量核酸释放剂”法

优点：彻底废除了“移管、离心、弃液、洗脱等步骤导至的核酸外泄，核酸废液开放丢弃等环节。简单、快速！

缺陷：微量操作，超过普通操作人员的能力；PCR干扰因素及加样量少导至敏感性不足；依旧有吹打混匀的过程，核酸外泄依然无法避免。

“4G”：“磁珠”动态核酸制备

优点：敏感性提升，可实现仪器辅助的“自动化”

缺点：存在“移管、离心、弃液、洗脱等步骤导至的核酸外泄，核酸废液开放丢弃等环节”，污染难控。不成熟的仪器自动化，增加了洗脱污染的机会和低值样本重复性差的缺陷。

1G~4G技术的共同特征是：移液、移管、洗脱等动态操作导至核酸外露，实验室污染是最大的问题。只有废除缺陷步骤，才能真正解决实验室污染问题和实现准确检测。

“5G”：静态核酸制备技术

“静态核酸制备技术”操作流程图

优点：

（1）污染可控

临床实验室污染可控与杜绝污染。

（2）重复性好

①检测样本加入核酸裂解液中无需混匀：无释放核酸外露；对操作人员技术要求低；

②超强磁珠吸附：废液无磁珠丢失，无核酸外露；

③静态漂洗、磁珠无需分散、无核酸移动；

④磁珠参与PCR扩增，无核酸洗脱步骤。

（3）敏感性高

①裂解液、漂洗液少量残留无影响；

②整个过程无核酸丢失；

③参与PCR扩增的构象磁珠无干扰抑制。

（4）滚动报告

快速、低成本、效率高

不足：

    未实现自动化