【冯仁丰】介绍2020年的ISO 17511文件第二版（19）

前几个微信，我向大家介绍了几个在ISO 17511第二版中讲述的溯源情况。大家有没有注意到，既有参考物质、又有参考方法的那些溯源情况，很明确，终端用户对病人样品的检测结果，可以上溯沿着箭头，最后到达最高等级的参考物质或参考方法，实现了溯源性。但是，前面那个C-反应蛋白（CRP），它的参考物质是欧洲的ERM-DA472/IFCC。对这个参考物质确定内含CRP含量使用的检测方法，不是今天认识的那些参考方法，也不是具有任何较高等级的参考物质。前面CRP介绍的微信中，我更多地了解到，这个ERM-DA472/IFCC参考物质，与40年前确定CRP浓度的那个CRM 470一样，应该认识到，为CRP定值没有一个被国际认可的参考物质，也没有一个被国际认可的参考方法。因此，严格讲，这至多是一个国际上经过协商合作得到的CRP参考值的参考物质，即为国际约定的校准品。严格讲，不可溯源到SI单位。但是，现在的专家们，将这个CRP参考物质捧高了！

这个微信，我介绍的是认识国际约定校准品的情况。

这次ISO 17511第二版介绍的国际约定校准品以WHO批准的、以生物活力表示国际的参考标准，它们的溯源校准等级的情况。

前面我向大家介绍了在ISO 17511第二版中介绍的，如何理解以一级参考物质与一级参考方法、或以一级参考物质、或以参考方法为校准最高等级，通过病人标本将它们的正确度逐级往下传递，直至在临床实验室，可以使用具有溯源性的厂商产品，对病人标本的检测结果，在量值上具有溯源性。

  我在前面一个介绍中，说到ERM-DA472为C-反应蛋白、以及ERM-DA470k为多个蛋白的参考物质。这些参考物质的制备和定值，与原先作为一级参考物质间有很大的不同。一个是这些参考物质均不是纯物质，它们具有以人混合血清为基质的；为了提高参考物质内需要确定定值的那些蛋白，人为地添加了被纯化的那些蛋白；尤其是对于它们的定值，目前尚未有国际认可的参考方法；因此，只能采用临床实验室目前常用的那些检测方法，有一个专家组确定选择哪些公司的检测试剂和方法，可以用于对参考物质定值。当然，这些公司的原有校准品没有采用，而是由专家组确定，使用某个在上世纪的1992年，在为原CRM470定值时，指定的某个纯化物质，作为对某个蛋白采用常规检测方法的校准品。被选定的免疫方法为：免疫散射比浊、免疫透射比浊、以及免疫扩散方法。在上世纪90年代，为CRM470 定值时的免疫散射比浊和免疫透射比浊，是抗原与抗体结合形成的免疫复合物产生的浊度，灵敏度很差。因此当时都认为免疫散射比浊方法是超过了免疫透射比浊方法，可是，在本世纪的第一个年代与现在，开展免疫比浊的技术，都采用了胶乳作为检测抗体的载体。因此，免疫形成的抗原抗体复合物，在胶乳颗粒参与下形成的免疫复合物的巨大颗粒，远远大于单纯的抗原抗体反应的复合物，极大地放大了免疫浊度的检测灵敏度！所以，今天再使用免疫散射比浊技术，在实际应用中不如免疫透射比浊技术了！因为透射比浊可以在一般的比色仪器上使用，不需要使用专门的散射比浊仪器，极大地提高了临床应用范围。因此，ERM-DA472和ERM-DA470k的定值的可靠性，是20年前CRM470的定值不可比拟的。但是，无论如何，这样的参考物质，为它定值使用的检测方法完全是常规方法。与前述的那些参考物质，完全是在国际认可的最高等级研究院内的实验室，采用了与常规完全不同的方法进行定值的。

因此从这样的认识上，这样的参考物质与前述的国际参考物质水平不可一概而论。

  还有，ERM-DA472和ERM-DA470k的定值，是采用了许多参加实验室参与、使用相同检测原理的方法、以及归纳了所有三个不同检测原理的方法检测值，归纳在一起，采用了总均值表示它们参考物质的定值。这是与最高等级的参考物质定值在水平和做法上是完全不同的。这个均值是免疫检测所有程序的修整均值（the all-procedure trimmed mean of immunoassay）。采用这样均值为参考物质的定值的，从上世纪的90年代，欧洲为CRM 470参考物质的定值是这样做的。接着，在为本世纪出现的ERM-DA470k和ERM-DA472参考物质的定值，都是这样的做法。

  在免疫的蛋白检测中，还有被国际上认可的参考物质，有相当多的认可参考物质来自世界卫生组织（WHO）批准的蛋白标准物质。限于国际上对蛋白检测没有被认可的免疫检测技术，可以为这些参考物质定值，因此，国际上对许多参考物质，使用了传统的、以这些蛋白具有的生物活性，建立了国际认可生物活性的参考方法。可是使用生物活性检测对这样的蛋白标准，确定它们的生物活力定值，检测的艰难程度可想而知。但是，在众多被国际认可的生物活性检测参考实验室，一组参考实验室为一个蛋白物质进行生物活性的标准定值，尽管有了参考值，但是这个定值的变异系数很大。而且不同实验室的生活活性的检测方法和检测结果间还有许多差异。对于这些被WHO批准的参考物质，有了生物活性的单位，被命名为国际单位（IU，International Unit）。

  但是，这样的参考物质在实际应用中，除了对某些实验室确实需要以生物活性方法对样品进行检测外，绝大多数是被体外诊断厂商，使用这个参考物质，对它们的免疫检测技术进行定值。不同诊断厂商的公司使用的抗体不同、不同抗体抗的是不同的抗原决定簇、是多克隆的还是单克隆的抗体、使用的检测技术不同等，尽管使用了相同的WHO的某个蛋白为标准，但是各个不同诊断厂商尽管使用了相同的WHO标准物质，使用在各个公司的免疫检测技术，最后不同公司对相同病人样品内的某个蛋白检测结果有很大的差异。这样的问题困扰了临床有很长久的历史。每个公司都采用了相同的WHO标准物质，都使用了免疫检测技术，但是最后对相同病人的标本的相同分析物检测结果，有着很大的差异。例如对促甲状腺素（TSH）的情况就是这样。究竟应该怎样做，成了世界难题。

  这些被测量在溯源中的量值的传递，就是按照第5.5节的内容进行的。以下为摘录的第5.5节的内容。

5.5 定义了被测量的国际约定校准品的情况

5.5.1 通用考虑

在图4中描述的校准等级，须应用在定义了被测量（见图4,m.3）的一个国际约定校准品，它符合了ISO 15194的要求。对于这些类型可检测的量，没有RMP（见图4,p.2）、没有一级RM（见图4,m.1）或一级校准品（见图4,m.2）、和没有溯源性到SI。对国际约定校准品（见图4,m.3）的设定值，被测量具有一个指定值，被一个国际认可的值设定方案（见图4,p.3）设定，包含了为特定被测量最高水平的计量溯源性。在5.5.2至5.5.9中详尽地阐述了这些类型的校准等级的描述中要解决的特征。

图4-- 校准等级-- 由国际约定校准品（符合ISO 15194，没有SI溯源性）设定值方案定义的被测量。没有可用（N/A）的物质[m.1]和[m.2]，和MP[p.1]和[p.2]。

5.5.2 国际约定校准品 --物质描述

国际约定校准品（见图4,m.3）应是一个含有被测量（见3.17）的制品。在适当情况下，制备校准品的物质，应具有类似预期被IVD MD检测的人样品的基质，使它更有可能，RM（见图4,m.3）应与人样品在MP（如[图4,p.3和/或p.5]）中是可互换的，这些MP在确定的校准等级中被预期校准。

注1：该被测量通常存在于特征明确的形式，经典地含有在类似被终端用户IVD MD检测原始的人样品的基质内。

示例：提供的国际约定校准品，处于紧密地类似于预期被特定IVD MD检测的人的原始样品（如，混合血清、混合尿液）的基质中。

注2：有时没有国际约定校准品，可直接用作某MP的校准品的合适形式可用。有些国际约定校准品提供的为粉末或冷冻干燥物，要求使用前用适当的稀释剂稀释。在一些情况下，校准品提供者在使用说明中，提供了制备和稀释的说明。

5.5.3 国际约定校准品值的设定

一个国际约定的方案（见图4,p.3）应被用于为国际约定校准品（见图4,m.3）设定量值。

注1：一个方案的示例是一个计划，在一组具有被认可具有合适性能特性的一组MP间，确定了国际约定校准品被测量（去除离群值后）的均值。确定性能特性适用性通常依据对一组人样品检测的结果，并包括了，特别考虑：不精密度、选择性、相关、程序间差异的减少，在候选国际约定校准品被用来重新校准该程序时，连同其他关键影响量。

注2：WHO生物标准专家委员会（ECBS）建立了国际生物RM。被称为“国际标准（IS）”（以往“国际参考制品（IRP）”）用于生物程序和免疫程序。这些物质的第一批，定义了“国际单位”为该物质的指定的特定量，并被它特定的生物活性确定。以后批由实验室间合作检测相对于以往物质校准。系列中以后批被指定为“1st IS”，“2nd IS”，等。这样一个RM的设定值，即使它被高度纯化，与专用的生物MP有关（或其他国际认可方案），没有计量溯源性到SI单位。所以，这样的物质，不可被称为一级RM。这些国际约定RM只能用作IVD MD的校准品，如果该物质依据预期医学应用关联的量的明确定义为基础形成的，和如果该物质的设定值具有的不确定度，对IVD MD校准是可接受的。

5.5.4 国际约定校准品的互换性

国际约定校准品与人样品的互换性，应有代表数量的不同IVD MD确认，与校准品的预期用途一致。国际约定校准品的提供者，在为它预期用途的第一次发出该物质前，应实施互换性评估。负责为一个特定IVD MD确定的校准等级的厂商，要负责任何更多互换性评估，若可应用，作为确保被选择的国际约定校准品是合适用于特定IVD MD所需。

注1：在国际约定校准品（或任何其他校准品）中使用了类似人样品基质的，没有确保产生的校准品实际上是一个可互换的物质。

注2：实施互换性评估的方案，可用CLSI EP30-A和其他发表的建议^[35]-[37]。

注3：为参与一个互换性研究选择MP，要考虑的因素，如市场分享、以及在关注被测量的可用IVD MD间的技术差异。

注：我的补充：我发现在ISO 17511的第二版中，在叙述为国际约定校准品下的溯源内容，与第一版显著不同。非常突出地强调了，国际约定校准品的互换性。因为这样，目前国际约定校准品，一般都是具有人样品内相似基质下的校准品。这点希望大家注意。

5.5.5 厂商选定MP的校准和选择

国际约定校准品（见图4,m.3）应被用于校准厂商选定MP（见图4,p.4）。厂商选定MP（见图4,p.4）应确定一个被一个或多个国际约定校准品校准的检测系统。该选定的MP，被适当校准后，应被用于确定厂商常设校准品（见图4,m.4）的设定值。

5.5.6 厂商工作校准品的特性和值的设定

厂商工作校准品（见图4,m.4）应具有按照厂商选定MP设定它的值。厂商工作校准品（见图4,m.4）应展现了和预期人样品的互换性，关于厂商选定MP（见图4,p.4）和厂商常设MP（见图4,p.5）的关系。

注：厂商工作校准品经常是一个具有类似被终端用户IVD MD检测的人样品类似基质的物质。厂商工作校准品在一些例子中，由一组或系列的混合人样品组成。

5.5.7 厂商常设MP

厂商常设MP（见图4,p.5）应确定一个MP，被一个或多个厂商工作校准品（见图4,m.4）、或较高类型的校准品，如国际约定校准品（见图4,m.3）校准，并被确认了分析选择性。

5.5.8 终端用户IVD MD校准品

终端用户IVD MD校准品（见图4,m.5）应具有按照厂商常设MP设定的值，被预期去校准终端用户IVD MD（见图4,p.6）。厂商（见4.7）应负责估计不确定度终端用户IVD MD校准品设定值的ucal，合并所有相应等级的不确定度，除了在校准品等级中以后MP的每一个不确定度外，往下到和包括厂商常设MP（见图4，p.5）。

5.5.9 终端用户IVD MD

终端用户IVD MD（见图4,p.6）应描述一个被一个或多个终端用户校准品校准的检测系统。这个MP，是定义的被测量校准等级中最后的MP，被用于检测人样品，并产生最后检测被测量的值，具有被终端用户估计的报告值的合并标准检测不确定度，在确定的校准等级中每一个较高步骤累积的所有已知检测不确定度。